Достижения в микробиологии: вклад Пастера, Коха и др. ученых

План

Достижения в микробиологии: вклад Пастера, Коха и др. ученых 3
Дисбактериоз, значение для макроорганизма 7
Простые методы окраски мазков 18
Дыхание микроорганизмов: аэробы, анаэробы, микроаэрофилы 21
Гнотобиоты, СПФ -животные, характеристика 24
Бактериоскопический метод. Приготовление фиксированных мазков-
препаратов 27
Список использованной литературы 30

Достижения в микробиологии: вклад Пастера, Коха и др. ученых

Микробиология – относительно молодая наука, ее история насчитывает немногим более 300 лет. В истории микробиологии можно выделить три периода: морфологический, физиологический и современный. Возникновение микробиологии как науки стало возможным после изобретения микроскопа. Первым, кто увидел и описал микроорганизмы, был голландский натуралист Антоний ван Левенгук (1632—1723), который сконструировал микроскоп, дававший увеличение до 300 раз. В микроскоп он рассматривал все, что попадалось под руку: воду из пруда, различные настои, кровь, зубной налет и многое другое.
В просматриваемых объектах он обнаруживал мельчайшие существа, названные им живыми зверьками (анималькулями). Он установил шаровидные, палочковидные и извитые формы микробов. Книга «Тайны природы, открытые А. Левенгуком», опубликованная в 1695 г., привлекла внимание ученых многих стран к изучению микроорганизмов. Открытие Левенгука положило начало возникновению микробиологии. Однако исследования в течение многих десятилетий сводились лишь к описанию микроорганизмов. Со второй половины ХIХ века началось бурное развитие микробиологии – физиологический период, связанный с именем величайшего французского ученого, химика по образованию, Луи Пастера (1822-1895).
Основной заслугой Пастера является то, что он впервые связал микроорганизмы с процессами, ими вызываемыми. Исследования Пастера завершили многовековой спор о возможности самопроизвольного зарождения жизни. Он экспериментально доказал, что в питательных средах, в которых убиты микроорганизмы, жизнь не зарождается даже при соприкосновении с воздухом, если в последнем они отсутствуют. Пастор доказал, что причина брожения и гниения — микроорганизмы, вырабатывающие различные ферменты.
Каждый бродильный процесс имеет специфического возбудителя; гниение вызывается группой гнилостных бактерий и т. д. С именем Пастера связано решение вопроса о самопроизвольном зарождении жизни на земле. Он экспериментально доказал, что при абсолютной стерильности питательных растворов и исключении возможности последующего загрязнения извне в них невозможно появление микробов и развитие гниения. Жизнь возникает тогда, писал Пастер, когда микроорганизмы в питательный раствор проникают извне. Пастер объяснил, что инфекционные болезни имеют микробиологическую природу и возникают в результате попадания в организм болезнетворных микроорганизмов.
Л. Пастер предложил метод борьбы с инфекционными заболеваниями при помощи прививок, для которых применяются культуры микроорганизмов с ослабленным болезнетворным действием (вакцины). Таким образом, Луи Пастер является основоположником всех основных направлений современной микробиологии. И.И. Мечников (1845-1916) создал фагоцитарную теорию иммунитета, основанной на способности клеток макроорганизма противостоять инородным телам; установил антагонизм между молочнокислыми и гнилостными бактериями; работал с возбудителями инфекционных болезней. В 1908 г. ему была присуждена Нобелевская премия. И. И. Мечников показал, что одним из важнейших механизмов, помогающим человеку бороться с проникшими в его организм болезнетворными микробами, является клеточная защита.
И. И. Мечников установил, что белые кровяные тельца — лейкоциты — захватывают и пожирают микробов, проникших в ткани человеческого организма. На месте проникновения микробов развивается воспалительная реакция, а гной — это погибшие лейкоциты. Клетки, пожирающие микробов, И. И. Мечников назвал фагоцитами (от греч. phagos — пожирающий, kytos — клетка). Разработке и доказательству фагоцитарной теории иммунитета он посвятил 25 лет жизни и был удостоен первой Нобелевской премии.
Много внимания И. И. Мечников уделял проблеме старения организма. Он полагал, что гнилостные микробы, живущие в толстом кишечнике человека, отравляют организм ядовитыми продуктами своей жизнедеятельности. Поэтому он предлагал использовать для борьбы со старостью антагонистические взаимоотношения микробов. Заменив гнилостную микрофлору кишечника на молочнокислую, которая находится в простокваше, можно, как считал И. И. Мечников, избежать поступления в организм ядовитых продуктов. Несмотря на то что проблема старения организма оказалась намного сложнее, чем полагал ученый, идея использовать один вид микроба в борьбе против другого (антагонизм) принесла существенные плоды. Она получила блестящее воплощение в применении антибиотиков для лечения инфекционных болезней.
С.Н. Виноградский (1856-1953) – основоположник почвенной микробиологии, установил роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе. Разработал методы выделения отдельных групп микроорганизмов с использованием элективных (избирательных) питательных сред. Широко известны исследования Виноградского в области общей и почвенной микробиологии. Он выяснил участие микроорганизмов в круговороте веществ в природе. Впервые (1889) ввел в микробиологическую практику элективные (избирательные) питательные среды, которые создавали условия для размножения определенного вида микроба. Так, засевая пробу почвы в питательную среду, не содержащую азота, В. впервые (1893) получил культуру анаэробной спороносной бактерии Clostridium Pasteurianum, усваивающей атмосферный азот.
Ему принадлежит открытие явления хемосинтеза и описание важнейших групп хемосинтезирующих бактерий. Еще в 1887 открыл существование совершенно особой группы микробов, способных окислять неорганические соединения и использовать образующуюся при этом энергию на усвоение углекислоты, содержащейся в воздухе, что дает возможность микроорганизмам развиваться в средах, не содержащих органических веществ. К хемосинтезирующим микроорганизмам относятся: серобактерии, окисляющие серу; нитрифицирующие бактерии, окисляющие аммиак в нитриты, а затем в нитраты; железобактерии, переводящие закисные соединения железа в окисные, и др.
Ему принадлежит также серия работ по микробиологии почвы. В них описаны новые методы изучения почвенной микрофлоры, в частности метод прямого подсчета клеток почвенных микробов, окрашенных в препаратах. Применение этого метода помогло выяснить, что в почве содержится гораздо больше микроорганизмов, чем считалось раньше.
К этим работам относятся также исследования Виноградского по физиологии аэробной азотфиксирующей бактерии — азотобактера, по аэробным целлюлозным бактериям и др. Одним из первых указал на необходимость изучать микроорганизмы в условиях их естественного местообитания и неоднократно подчеркивал важность дальнейшего развития экологической микробиологии.
Дисбактериоз, значение для макроорганизмаДисбактериоз не является самостоятельным заболеванием. Это состояние, при котором нарушается динамическое равновесие между характерной для каждого отдела желудочно-кишечного тракта микрофлорой и влиянием разнообразных факторов окружающей среды. При этом изменяется как количественный, так и качественный состав микрофлоры. Нередко эти изменения негативно влияют на функцию кишечника, что проявляется вздутием живота, урчанием, болью в животе, расстройством стула и другими симптомами диспептического характера.
Дисбактериоз – это сложный симптомокомплекс, характеризующийся количественными и/или качественными изменениями микробиоценоза кишечника.
Согласно отраслевому стандарту дисбактериоз - это не только количественное и качественное изменение кишечной микрофлоры, под дисбактериозом кишечника понимают клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций и характеризующийся:
•симптомами поражения кишечника
•изменением качественного и/или количественного состава нормальной микрофлоры
•транслокацией различных микроорганизмов в несвойственные биотопы
•избыточным ростом микрофлоры
В норме избыточному росту бактерий в тонкой кишке препятствуют:
•нормальная секреция соляной кислоты (предотвращает размножение бактерий в верхних отделах ЖКТ)
•илеоцекальный клапан (предупреждает поступление бактерий из толстой кишки в тонкую)
•нормальная пропульсивная моторика тонкой кишки (препятствует застою кишечного содержимого)
В норме флора кишечника представлена четырьмя основными микроорганизмами. Это бифидобактерии, бактероиды, молочнокислые бактерии и кишечная палочка. Конечно, разновидностей микроорганизмов, живущих в кишечнике, гораздо больше. Но перечисленные выше играют основную роль.
Значение нормальной микрофлоры для организма:
•Кишечные палочки, энтерококки, бифидобактерии и ацидофильные палочки в условиях нормально функционирующего кишечника способны подавлять рост вредных микроорганизмов.
•Внутренняя поверхность кишечника надежно защищена от проникновения чужеродных белков, микробов и вирусов. Важную роль в организации этой защиты играет иммунная система организма. Кишечная микрофлора стимулирует иммунную защиту.
•Расщепление непереваренных пищевых веществ в толстой кишке осуществляется ферментами бактерий, при этом образуются разнообразные соединения. Токсические продукты микробного метаболизма (кадаверин, гистамин и другие амины) выводятся с мочой и в норме не оказывают влияния на организм. При утилизации микробами неперевариваемых углеводов (клетчатки) образуются короткоцепочечные жирные кислоты. Они обеспечивают клетки кишки энергией и, следовательно, улучшают питание слизистой оболочки. При дефиците клетчатки может нарушаться проницаемость кишечного барьера вследствие дефицита короткоцепочечных жирных кислот. В результате кишечные микробы могут проникать в кровь.
•Под влиянием микробных ферментов в подвздошной кишке происходит преобразование первичных желчных кислот во вторичные. В физиологических условиях от 80 до 95% желчных кислот всасывается обратно остальные выделяются с фекалиями в виде бактериальных метаболитов. Последние способствуют нормальному формированию каловых масс: тормозят всасывание воды и тем самым препятствуют возникновению запоров.
Часть микроорганизмов благодаря адгезивным свойствам плотно связана с внутренней поверхностью кишечника, общая площадь которого составляет около 200 м2. Другая часть сосредоточена в просвете кишечника. Количество микроорганизмов увеличивается в дистальном направлении, и в толстой кишке в 1 г кала содержится 1011 бактерий, что составляет 30% сухого остатка кишечного содержимого.
В содержимом тощей кишки здоровых людей может находиться до 105 бактерий в 1 мл кишечного содержимого. Среди них основную массу составляют стрептококки, стафилококки, молочно-кислые палочки, другие грамположительные аэробные бактерии и грибы. В дистальном отделе подвздошной кишки количество микробов увеличивается до 107–108, в первую очередь за счет энтерококков, кишечной палочки, бактероидов и анаэробных бактерий.
Развитие дисбактериоза можно представить в виде следующих фаз:
•значительное уменьшение числа нормальных симбионтов в естественных местах их обычного обитания
•полное исчезновение некоторых видов симбионтов и увеличение содержания атипичных форм, а также микробов, в норме не встречающихся в организме
•появление микробов в полостях, органах и тканях, в которых они обычно не встречаются (в желчных путях, в моче, в крови и т.д.).
Уменьшение нормальных симбионтов обычно не сопровождается клиническими проявлениями. Но уже на этой стадии нарушается одна из главных функций, осуществляемых нормальной флорой - защита организма от агрессии болезнетворных микробов.
В условиях ослабления защитных свойств организма, преимущество в размножении могут получить гнилостные микробы или грибковая флора, что приводит к развитию местных воспалительных процессов (стоматит, заеды, бронхит, энтерит, налеты на слизистых и т.д.).
Развитие гнилостной флоры в кишечнике приводит к возникновению процессов гниения (разложение белков с образованием фенола, скатола, индола, крезола, сероводорода, аммиака и др. токсических веществ), и процессов брожения.
Образующиеся продукты гниения и брожения, а также растяжение кишечника газами обуславливает возникновение ряда симптомов: расстройство стула, метеоризм, отрыжку, неприятный вкус во рту, боли разного характера (колики, спазмы).
Внутрикишечное образование токсических веществ ведет к повышенному проникновению их в кровоток, что сопровождается нарушением общего самочувствия (утомляемость, раздражительность, головные боли, сосудистая дистония и др.), а также развитием симптомов непереносимости определенных пищевых продуктов (аллергия).
Нарушение пищеварительных процессов при дисбактериозе приводит к нарушению обмена веществ – жирового, углеводного, белкового, водно-солевого, обмена витаминов. К признакам нарушения обмена относят потерю веса, недостаток выделения желчных кислот, дефицит жирорастворимых витаминов (сухость кожи, ухудшение зрения). При дисбиозе происходит активное снижение усвоения кальция, что приводит к остеопорозу (ломкость костей, онемение пальцев рук и ног, судороги).
Как видно, проявления дисбактериозов весьма разнообразны: от бессимптомного течения до четко очерченных тяжело протекающих клинических форм.
Причины, которые могут вызывать дисбактериоз кишечника (по принятой научной этиологической классификации дисбактериоза):
•дисбактериоз у практически здоровых людей - он бывает возрастной, сезонный, нутритивный и профессиональный
•дисбактериоз сопровождающий заболевания желудочно-кишечного тракта - среди них заболевания желудка со снижением кислотности (анацидный гастрит), болезни поджелудочной железы (панкреатит), печени и желчевыводящих путей, заболевания кишечника, а также синдром мальабсорбции любого генеза.
•дисбактериоз при различных заболеваниях и повреждениях организма - при инфекциях и паразитарных заболеваниях (лямблиоз, трихомоноз), гельминтозах (острицы, аскариды и другие), аллергии, иммунодефиците, гиповитаминозе, интоксикациях, гипоксии, воздействии радионуклидов
•лекарственный дисбактериоз – развивается при длительном приеме антибиотиков, сульфаниламидов, гистаминоблокаторов, туберкулостатиков, иммунодепрессантов, антацидов, слабительных средств
•стрессорный дисбактериоз – данный тип дисбактериоза выделен недавно
Наиболее характерными симптомами дисбактериоза являются расстройства стула, неустойчивый стул, диарея. Диарея при дисбактериозе обусловлена образованием в кишках большого количества деконъюгированных желчных кислот. Они оказывают послабляющее действие, тормозят абсорбцию воды в кишечнике, вызывают структурные изменения его слизистой оболочки.
Запоры, возникающие в основном при возрастном дисбактериозе, атеросклерозе и хронических колитах, обусловлены тем, что микрофлора утрачивает способность стимулировать перистальтику толстой кишки.
Второй симптом дисбактериоза – метеоризм. Он связан с повышенным газообразованием в толстой кишке при дисбактериозе, нарушением абсорбции и удаления газа вследствие изменений в стенке кишечника. Он вызывает тягостные ощущения, сопровождающиеся неприятным вкусом во рту, жжением в области сердца, нарушениями его ритма, слабостью, разбитостью, нервозностью. Если метеоризм нарастает остро, можно наблюдать так называемую диспепсическую астму: вздутие живота, резкая одышка, похолодание конечностей, расширение зрачков.
При кишечном дисбактериозе часто имеет место урчание в животе, которое возникает вскоре после приема пищи и сопровождается гастроцекальным рефлексом.
Наиболее часто дисбактериоз кишечника сопровождается болью в животе. Боль обычно монотонная, тянущего и распирающего характера, усиливается во второй половине дня, сопровождается метеоризмом, в некоторых случаях - сильная, коликообразная.
Синдром желудочно-кишечной диспепсии характеризуется сохраненным аппетитом, ощущением полноты в подложечной области, аэрофагией, отрыжкой, тошнотой, метеоризмом и затруднением дефекации. При этом нарушается моторика кишок, возникает дискинезия. Она проявляется болью в животе типа кишечной колики, после которой обычно развивается гиперкинезия кишечника, наступает опорожнение и боль прекращается. Дискинезия возникает вследствие брожения органических кислот, раздражающих слизистую оболочку. В избытке выделяется С02, вызывая метеоризм. Усиленное слизеотделение раздраженной стенкой кишки приводит к гниению.
Образующийся при этом метан, сероводород, метилмеркаптан усиливают метеоризм. Гнилостная диспепсия в чистом виде встречается только в четвертой стадии дисбактериоза. Вследствие нарушения процессов брожения и гниения изменяется вид и состав кала. При усиленном брожении кал кашицеобразный, жидкий, пенистый, светлой окраски, с кислым запахом, вызывает жжение в заднем проходе. При преобладании гниения кал зловонный, отходящие газы с сильным неприятным запахом.
При кишечном дисбактериозе нередко наблюдаются симптомы полигиповитаминоза. Дефицит тиамина проявляется нарушением моторики пищеварительного канала со склонностью к атонии, головной болью, дистрофическими изменениями в миокарде, нарушением периферической нервной системы.
Дефицит никотиновой кислоты сопровождается раздражительностью, подавленностью, неуравновешенностью настроения, явлениями глоссита с ярко-красной окраской слизистой оболочки языка, зева, рта, повышенным слюноотделением.
О недостаточности рибофлавина свидетельствуют ангулярный стоматит, изменения слизистой оболочки губ с мацерацией и трещинами глоссит с синевато-красным окрашиванием языка, дерматит на крыльях носа и в носогубных складках, изменения ногтей и выпадение волос. Нерезко выраженная кровоточивость также может быть симптомом дисбактериоза.
Одной из причин длительного недостатка пиридоксина (витамина В6) в организме является дисбактериоз, который сопровождается резким снижением количества Е.coli в кишечнике. При этом имеет место головная боль, слабость, дистрофические изменения в миокарде. Недостаточный синтез цианокобаламина и фолиевой кислоты, а также конкурентное использование их условно патогенной и патогенной микрофлорой приводит к развитию нормохромной, редко гиперхромной анемии.
Дефицит витамина Р сопровождается раздражительностью, подавленностью настроения, слюнотечением, иногда кровоточивостью дёсен.
Ранними симптомами гипокальциемии, развивающейся при дисбактериозе вследствие нарушенного обмена желчных кислот, считают онемение губ, пальцев, кистей рук и стоп. Более ранние признаки гипокальциемии бывают обусловлены не столько дисбактериозом, сколько тяжелыми изменениями слизистой оболочки кишок.
К симптомам дисбактериоза можно отнести и некоторые формы аллергии, например, хроническую пищевую крапивницу, так как микробы кишечника, благодаря декарбоксилазной активности могут вызывать повышенное образование гистамина и гистаминоподобных веществ. Измененная слизистая оболочка кишечника у больных не продуцирует гистаминазу, поэтому образованный в просвете толстой кишки гистамин не разрушается, а всасывается (диффундирует) в кровь.
Синдром недостаточности пищеварения (мальдигестия) - клинический симптомокомплекс, обусловленный нарушением переваривания пищевых веществ в результате дефицита пищеварительных ферментов на кишечных мембранах (нарушение мембранного пищеварения) и в полости тонкой кишки (нарушение полостного пищеварения). Основной причиной этих нарушений при дисбактериозе кишечника является заселение верхних отделов тонкой кишки большим количеством микроорганизмов, разрушающих пищеварительные ферменты, обусловливающих деконъюгацию желчных кислот и развитие бродильной или гнилостной диспепсии.
Для синдрома недостаточности пищеварения при дисбактериозе кишечника характерны:
•расщепление части пищевых веществ ферментами бактерий в верхних отделах тонкой кишки с образованием ряда токсических веществ (аммиак, индол, низкомолекулярные жирные кислоты и др.), вызывающих раздражение слизистой оболочки кишечника и интоксикацию при поступлении в кровь; усиление ферментативной активности микрофлоры в толстой кишке, приводит к повышенному образованию перечисленных токсических продуктов в дистальных отделах кишечника
•неполное расщепление или всасывание пищевых веществ, в том числе и в связи с недостаточным поступлением в кишечник и образованием в нем пищеварительных ферментов
•несвоевременное продвижение пищевого химуса по пищеварительному каналу (ускоренное или замедленное). Этот синдром, кроме того, встречается при врожденных ферментопатиях, энтеритах и других патологических состояниях тонкой кишки
Синдром недостаточности пищеварения характеризуется:
•Расстройством стула с преобладанием поноса, связанного с усиленной перистальтикой кишки, нарушением абсорбции воды и структурными изменениями слизистой оболочки кишки, возникающими от повреждающего действия, преимущественно деконъюгированных желчных кислот. При патологии тонкой кишки диарея проявляется «большим» стулом (жидкий неоформленный кал более 500 г/сут.), а при патологии толстой кишки - «малым» стулом (синдром раздраженной толстой кишки).
•Метеоризмом, обусловленным повышенным газообразованием, нарушением абсорбции и удаления газов. Вздутие живота и урчание усиливается во второй половине дня и ночью. Характерна отрыжка и неприятный привкус во рту.
•Болью различного характера:
-связанной с повышенным давлением в кишке, при патологии тонкой кишки она локализуется в области пупка, при патологии толстой кишки - в подвздошной области, уменьшается при отхождении газов и после акта дефекации;
-обусловленной регионарным лимфаденитом - постоянная с локализацией слева выше пупка и по ходу брыжейки тонкой кишки (зона Пергеса), усиливается при физической нагрузке и иногда после дефекации;
-возникающей в результате спазмов - спастическая, схваткообразная, уменьшающаяся после акта дефекации (признаки спастической дискинезии толстой кишки).
Нередко на первый план выступают симптомы непереносимости определенных пищевых продуктов, чаще молока. После его употребления у больных появляется диарея, испражнения становятся жидкими, объемными, пенистыми. Их беспокоят вздутие и боль в животе, иногда тошнота и рвота. Непереносимость молока всегда связана с патологией тонкой кишки, в том числе нередко с присоединением дисбактериоза кишечника.
При кишечном дисбактериозе нарушение пищеварительных процессов приводит к расстройству абсорбции пищевых веществ, так как продукты неполного гидролиза плохо всасываются. Вследствие этого страдает и общее состояние больных.
Аллергическая реакция в виде хронической пищевой крапивницы также нередко развивается на фоне дисбактериоза кишечника. Для острой пищевой аллергии характерно внезапное начало болезни (вскоре после приема аллергена с пищей), появление общих аллергических реакций - кожного зуда, апивницы, отека Квинке, бронхоспазма, полиартралгии, снижения артериального давления.
Если аллерген находится в повседневно принимаемой пише, то аллергические реакции повторяются. Стертая форма - хроническая пищевая аллергия наиболее характерна для дисбактериоза с синдромом нарушенего пищеварения.
При этом нелегко бывает установить природу аллергена, тем более что повторные аллергические реакции сами по себе приводят к функциональным и органическим нарушениям различных органов и в первую очередь пищеварительного канала.
При приеме пищи, содержащей пищевые аллергены, может развиться катаральное, афтозное или язвенное поражение полости рта (гингивит, глоссит, стоматит), а также эзофагит и кардиоспазм. Чаще при пищевой аллергии поражаются желудок, тонкая и толстая кишка. Наблюдаются типичные симптомы гастрита, сходные с синдромом раздраженного желудка (боль или тяжесть в эпигастральной области, горький вкус во рту, отрыжка, изжога, тошнота, рвота, причем рвотные массы содержат большое количество желудочного сока за счет гиперсекреции), напряжение брюшной стенки. Поражение кишечника характеризуется схваткообразной, реже ноющей, тупой болью в животе, урчанием, вздутием и переливанием, а также императивными позывами на опорожнение кишечника. Появляется частый жидкий стул, нередко с примесью непереваренной пищи, реже крови.
Простые методы окраски мазковДля простого метода окрашивания микропрепаратов чаще всего пользуются основными анилиновыми красителями. Очень широко применяют метиловый синий, основной фуксин, кристаллический фиолетовый, тионин.
Простой метод окрашивания может быть применен как для окрашивания убитых микробных клеток в фиксированных микропрепаратах, так и для прижизненной окраски микроорганизмов.
Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные организмы длительное время остаются живыми и способными к размножению. Существует несколько способов прижизненной окраски, в том числе и способ Nakanischi.
При этом способе чистое предметное стекло обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини, высушиваю и обтирают сухой тряпочкой до тех пор, пока налет краски не примет светло – голубого оттенка. На покровном стекле приготовляют мазок из исследуемых микробов, после чего не высохший до конца препарат накладывают на предметное стекло с красителем. При помощи микроскопа можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми, не теряя своей активной подвижности (если таковой обладают), постепенно окрашиваются в синий цвет.
Этот метод ценен тем, что при его применении отсутствует опасность образования искусственных продуктов обработки, в возможности выявления некоторых функциональных особенностей микробной клетки.
Среди простых методов окраски существуют как позитивные, так и негативные способы окрашивания.
К простым позитивным методам окраски относится окраска по методу Лнеффлера, а к негативным – окрашивание по методу Бури.
Для окраски по методу Леффлера (Loffler) можно применить раствор метиленового синего (краситель Леффлера), который позволяет выявить многие детали формы и структуры микроорганизмов. Краситель Леффлера представляет собой смесь двух растворов А и Б.
Раствор А: метиловый синий – 0,3г, этиловый спирт – 30,0мл.
Раствор Б: КОН (0,01%) – 100мл.
Смесь хорошо сохраняется во флаконе с притертой стеклянной пробкой.
Для получения более чистых препаратов, краску можно наливать на мазок, покрытый фильтровальной бумагой, или использовать фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем и высушенную. В таком случае на фиксированный мазок накладывают полоску сухой пропитанной красилелем фильтровальной бумаги, а затем на бумагу пипеткой наносят несколько дистиллированной воды и пинцетом или шпателем прижимают фильтровальную бумагу к стеклу. Краситель вымывается из бумаги и окрашивает мазок. По истечении времени окрашивания, фильтровальную бумагу снимают, препарат промывают осторожно струей воды, высушивают и микроскопируют.
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными будут только микробные клетки.
Помимо позитивных способов окраски в некоторых случаях применяются негативные (контрастные) способы. В этом случае микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частички на равномерно окрашенном фоне.
Очень часто для негативного окрашивания микропрепаратов пользуются жидкой черной тушью («негативный способ» Burri).
По способу Бури фон препарата заливают жидкой тушью. Тушь не является истинным красителем, поэтому тела микробов остаются неокрашенными; вследствие чего получается, как бы негативное их изображение.
При этом способе тушь разбавляют водой в соотношении 1:9, 1:1 или 1:2.
Поскольку тушь сама по себе может содержать бактерии, ее стерилизуют, добавляя несколько капель формалина или автоклавируют 30 минут при 110 градусах. Перед употреблением подготовленная тушь (разбавленная и стерильная) должна в течение двух – трех недель сохраняться в спокойном состоянии, чтобы осели взвешенные в ней частицы. При приготовлении тушевых препаратов используется верхняя часть отстоявшейся жидкости.
Каплю черной туши наносят на предметное стекло и тщательно смешивают с каплей микробной взвеси. Смесь тонким слоем размазываю по поверхности предметного стекла краем покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат фиксируют и исследуют с помощью микроскопа. Микробные клетки видны в виде бесцветных телец, а темном фоне препарата.
Кроме жидкой туши для негативного окрашивания можно использовать водные растворы конгорот (3%0, нигрозина (10%) и некоторых других красителей. Окрашивание негативными красителями можно проводить двумя способами: либо раствор красителя наносить на сухой фиксированный мазок, после промывки водой и высушивания микроскопировать; либо каплю исследуемой суспензии микробов смешивают с красителем, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. И в том, и в другом случае микробные клетки будут бесцветными.
Дыхание микроорганизмов: аэробы, анаэробы, микроаэрофилыКислород входит в состав молекул воды, органических и неорганических соединений, присутствует в современной атмосфере в виде молекулярного кислорода (О2), объемная доля которого составляет 21%. Кислород является обязательным химическим компонентом любой клетки.
Подавляющее большинство организмов удовлетворяет свои потребности в этом элементе, используя обе формы кислорода. 100%-и молекулярный кислород подавляет рост всех облигатных аэробов.
Многие аэробные бактерии могут формировать колонии на поверхности твердой питательной среды в атмосфере, содержащей 40% О2, но рост их прекращается, когда содержание О2 в атмосфере повышается до 50%.
В отношении к молекулярному кислороду прокариоты могут быть разделены на несколько групп:
I. АЭРОБЫ
1. ОБЛИГАТНЫЕ
а) Растущие на воздухе
б) Микроаэрофильные
2. ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ
II. АНАЭРОБЫ
1. ОБЛИГАТНЫЕ
а) Строгие
б) Аэротолерантные2. ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ
Облигатные (обязательные) аэробы – прокариоты, для роста которых О2 необходим. К ним относится большинство прокариотных организмов.
Микроаэрофилы – аэробы, не способные к росту при концентрации О2, равной атмосферной, но могут расти, если содержание О2 в окружающей среде будет значительно ниже (порядка 2%).
Факультативные аэробы или анаэробы – прокариотные организмы, которые могут расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Бактерии этой группы не нуждаются в О2 (последний не участвует в осуществляемых ими метаболических реакциях), но способны расти в его присутствии. Примером таких организмов служат молочнокислые бактерии. Многие прокариоты, относящиеся к этой же группе, приспособились в зависимости от наличия или отсутствия О2 в среде переключаться с одного метаболического пути на другой, например с дыхания на брожение, и наоборот.
Облигатные анаэробы – прокариоты, для метаболизма которых О2 не нужен, т. е. энергетические и конструктивные процессы у них происходят без участия молекулярного кислорода. К ним относятся метанобразующие архебактерии, сульфатвосстанавливающие, маслянокислые и некоторые другие эубактерии. Облигатные анаэробы получают энергию в процессах анаэробного дыхания, т. е. переноса электронов по цепи переносчиков на СО2, SO42-, фумарат и другие акцепторы.
Строгие облигатные анаэробы – не выносят присутствия даже незначительных количеств молекулярного кислорода в среде и быстро погибают. К числу строгих анаэробов относятся представители родов Bacteroides, Fusobacterium, Butyrivibrio, Methanobacterium и др.
Аэротолерантные анаэробы - бактерии, умеренно (Clostridium tetani, С. carnis, С. tertium, С. sporogenes) или достаточно высоко (С. perfringens, С. acetobutylicuni) толерантные к О2, могут расти в присутствии воздуха.
Рис.1. Типы дыхания у микроорганизмов
Гнотобиоты, СПФ -животные, характеристикаГнотобиоты – животные, выращенные в специальных полностью изолированных от внешнего мира условиях, лишенные микроорганизмов и других форм жизни («стерильные» животные).
Организм гнотобиотов или совершенно лишен микроорганизмов, простейших и паразитов, или имеет определенную, строго контролируемую исследователями микрофлору.
Мысль о возможности выведения в искусственной среде животных, лишенных микроорганизмов, высказывал Л. Пастер. Он разработал схему получения стерильных цыплят.
Л. Пастер считал, что жизнь животных не может протекать нормально без микроорганизмов, в то время как некоторые его современники предполагали, что микрофлора причиняет макроорганизму только вред. Поиски безмикробных животных, обитающих на земле, не увенчались успехом, но доказано, что ряд птиц и животных Арктики обладают очень скудной микрофлорой.
Исследования по выращиванию гнотобиотов показали, что жизнь животных возможна без сопутствующих микроорганизмов, которые постоянно обитают в кишках и других полостях организма.
Первыми гнотобиотами стали в начале XX в. цыплята и морские свинки, т.е. животные, которые сразу после рождения могут поедать корм.
Гнотобиология – новая отрасль науки, которая успешно стала развиваться в сороковых годах нашего столетия благодаря достижениям науки и техники, созданию сложных, дорогостоящих и точных приспособлений (камер-изоляторов), обеспечивающих полную стерильность содержания и кормления животных. В 1944 г. в Нью-Йорке был проведен первый симпозиум по выведению и использованию безмикробных животных. Гнотобиологический эксперимент основывается на беспрерывном обеспечении безмикробных условий жизни гнотобиотов.
Для поддержания стерильности и заданной микрофлоры основным оборудованием в гнотобиологических лабораториях служат изоляторы различных размеров и конструкций (из нержавеющей стали, акриловых пластмасс, поливинилхлоридной пленки) с использованием комплекса методических приемов.
Такие изоляторы имеют камеры для содержания гнотобиотов, устройства стерильного воздухообмена, шлюзовую систему, с помощью которой в камеру, где пребывают гнотобиоты, вносят стерильный материал, а из нее удаляют остатки корма и кал. Камера, в которой живут гнотобиоты, оборудована манипуляционными перчатками, позволяющими захватывать животное, делать ему инъекции и т.д.
Получают безмикробных животных от беременных самок, которым проводят кесарево сечение в определенный период перед родами. Существуют следующие два приема получения гнотобиотов.
Первый – гистерэктомия, когда у беременной самки под наркозом ампутируют матку с плодами, перевязывая ее в области шейки, после чего проводят через гидрошлюз изолятора (он заполнен 5 %-м раствором хлорамина или другим дезинфицирующим раствором) в безмикробное пространство камеры, после чего плоды извлекают, освобождают их от оболочек, перевязывают пуповину, осушают, а матку с плацентой удаляют.
Второй способ – гистеротомия – более совершенен, так как при нем отсутствует контакт матки и плодов с окружающей средой. Достигается это благодаря специальному хирургическому изолятору, который в дне камеры имеет операционное отверстие, герметически закрываемое эластической пленкой типа «Саран».
Извлечение плодов из матки проводят внутри камеры-изолятора через пленку и склеенные с ней кожные покровы самки. Новорожденных помещают на утепленной подстилке в клетке. Корм, воду, подстилку и другие материалы, необходимые для обеспечения жизнедеятельности безмикробных животных, подвергают стерилизации в вакуумном автоклаве.
В настоящее время не только получены безмикробн?