Медицинская биофизика

А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.

Направление «медицинская биофизика» ориентированно на использовании в медицине результатов фундаментальных исследований в области мембранных процессов, фотобиологии, биофизики клетки. Эти результаты медицина использует для познания на молекулярном уровне механизмов возникновения заболеваний, для ранней диагностики, для выработки способов воздействия на патологические процессы.

Важным направлением исследований в области биофизики клетки, имеющим прикладное медицинское значение, являются исследование функциональных свойств эритроцитов и связи изменения формы и объема клетки, а также вязкости и проницаемости клеточной мембраны, с конформацией гемопорфирина гемоглобина и эффективностью переноса кислорода. Выявлены изменения вязкости и проницаемости плазматической мембраны эритроцита и сродства гемоглобина к О2 и NO у больных артериальной гипертонией и ишемической болезнью сердца. Установлено, что при этих болезнях наблюдаются увеличение вязкости липидов различных областей плазматической мембраны, более высокие скорости Na+ /H+ - обмена, активность Са2+ - зависимых К+ - каналов и низкая активность Са2+ - АТФазы. Предполагается, что выявленные изменения вязкости и проницаемости плазматической мембраны снижают эффективность переноса кислорода гемоглобином при артериальной гипертонией и ишемической болезнью сердца. Установлен характер изменения вязкости плазматической мембраны эритроцита и сродства гемоглобина к О2 и NO у здоровых доноров, проживающих в условиях высокогорья. Вероятно, изменения в содержании комплексов гемоглобин — лиганд и гемоглобин — NO у доноров, проживающих в условиях высокогорья, повышают эффективность переноса кислорода гемоглобином.

Исследовано воздействия факторов космического полета (α- частицы и дейтроны, магнитное поле, оптическое, лазерное излучение) на функционирование нервной клетки и эритроцитов. Впервые обнаружены особенности связывания кислорода в эритроцитах человека в ходе космического полета. Выявлено увеличение вязкости и отношения содержания холестерина к содержанию фосфолипидов, а также увеличение специфической проницаемости плазматической мембраны для ионов Na+ и H+ и изменения конформации гемопорфирина гемоглобина. Установлено, что после космического полета обратимо снижается содержание гемоглобина и его комплексов. В ходе космического полета снижение числа дискоцитов осуществляется за счет увеличения числа трансформированных эритроцитов (книзоцитов и овалоцитов). По-видимому, в условиях космического полета связывание кислорода и содержание комплексов гемоглобина зависит от формы клетки, вязкости и проницаемости плазматической мембраны.

Методы адресной доставки лекарств и генетического материала в клетки

Эти исследования находятся на стыке биофизики, молекулярной биологии, биоинженерии, нанобиолотехнологии, фармакологии и онкологии. Одним из методов является опосредованный мембранными рецепторами эндоцитоз (см. иллюстрацию на последней странице обложки) — процесс избирательного концентрирования и поглощения клеткой веществ, для которых на плазмалемме существуют специфичные интернализуемые рецепторы.

Большое место в этих работах занимает проблема внутриклеточной доставки противораковых лекарств. Фотосенсибилизаторы − молекулы, генерирующие при освещении активные формы кислорода, − используются для фотодинамической терапии рака и ряда др. болезней; к сожалению, они вызывают поражение здоровых клеток и тканей, и другие побочные эффекты, причем их цитотоксическое действие ограничивается преимущественно плазматической мембраной. Для доставки фотосенсибилизаторов в наиболее чувствительную к ним мишень — ядро — сконструированы модульные рекомбинантные транспортеры (МРТ). В состав МРТ входят:

лиганд к интернализуемым рецепторам, обеспечивайщий поглощение МРТ клеткой,

эндосомолитический компонент, обеспечивайщий выход МРТ из эндосом в цитоплазму,

сигнал ядерной локализации, ответственный за транспорт МРТ в ядро клетки,

белок-носитель и

фотосенсибилизатор либо другой лекарственный компонент, который требуется доставить в ядро.

Для улучшения внутриядерной доставки конъюгатов применяются аттенюированные (ослабленные) аденовирусы, обладающие способностью образовывать поры в мембранах эндосом. Наиболее эффективные модульные конъюгаты оказались на несколько порядков более эффективными, чем свободные, неконъюгированные фотосенсибилизаторы. Транспортеры могут быть эффективно использованы для доставки других локально действующих лекарств − радионуклидов, испускающих альфа- частицы и также применяемых для терапии рака. Показано, что транспортеры могут увеличивать цитотоксическое действие источника альфа-эмиттера астата-211 примерно в десять раз.

МРТ придают фотосенсибилизаторам клеточную специфичность: конъюгаты фотосенсибилизатор-МРТ обладают в сотни и тысячи раз большей эффективностью в отношении клеток- мишеней, чем немодифицированные фотосенсибилизаторы, но − в отличие от последних − не фототоксичны в отношении клеток, не являющихся мишенями. Оказалось возможным заменять лигандные модули в составе МРТ, что позволило переключить МРТ на другой тип клеток-мишеней, а также существенно (более чем в 3000 раз) увеличить фототоксическую эффективность применяемых фотосенсибилизаторов.

При разработке метода рецептор-опосредуемой трансфекции предпринята попытка имитировать вирусный путь доставки генетической информации, используя искусственные конструкции. Известно, что вирусы эффективно переносят свой генетический материал в клетки-хозяева. У большинства вирионов есть:

компоненты, ответственные за узнавание интернализуемых (т.е. поглощаемых путем эндоцитоза после связывания с соответствующим лигандом) рецепторов на поверхности этих клеток,

компоненты, обладающие эндосомолитической активностью,

участки, обеспечивающие транспорт нуклеиновых кислот в ядро,

компоненты, обратимо связывающие нуклеиновые кислоты.

Удалось продемонстрировать возможность доставки генов in vivo, например, в эпителиальные клетки молочных желез с использованием конструкций, доставляющих ДНК путем рецептор-опосредуемого эндоцитоза. Этот же подход был эффективно использован и для трансфекции ранних эмбрионов млекопитающих.

Антимикробная фотодинамическая терапия

Антимикробная фотодинамическая терапия — новый перспективный метод лечения инфекций кожи и слизистых, основанный на избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном воздействии красителя (фотосенсибилизатора) и оптического излучения соответствующего спектрального состава.

При исследовании молекулярных основ фотодинамической инактивации клеток большое внимание уделяется комплексному определению параметров их жизнедеятельности: интенсивности дыхания, целостности плазматической мембраны и генетического аппарата. Это помогает установить механизмы действия фотосенсибилизаторов, их субклеточную локализацию и основные мишени окислительной деструкции. Разработан новый метод скрининга фотосенсибилизаторов с антибактериальной активностью по тесту фотоиндуцированного подавления биолюминесценции генно-инженерных штаммов бактерий.

В последние годы отмечается все ускоряющийся процесс развития лекарственной устойчивости патогенных микроорганизмов. В этой связи антимикробной фотодинамической терапии уделяется большое внимание, и этот метод рассматривается как альтернативный способ борьбы со штаммами возбудителей заболеваний, устойчивыми к действию традиционных лекарственных препаратов.

Разработаны новые и модифицированы известные методики качественной и количественной оценки внутриклеточной локализации и внутриклеточного движения макромолекул. В их число входят: методы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, метод восстановления флуоресценции после фотоотбеливания, позволяющий определять константы скорости и коэффициенты диффузии перемещающихся молекул в клетке, долю подвижных и неподвижных изучаемых молекул и др., методы радиационной инактивации, различные варианты видео-интенсифицированной микроскопии, включая методы деконволюции, поверхностный плазмонный резонанс и атомно-силовая микроскопия.

Разработка новых методов исследования часто приводит к появлению новых направлений в медицинской практике. Так произошло и в случае метода зондового микрофлуорометрического анализа клеток или метод флуоресцентных зондов. Активное его применение в последние десятилетия показало широкие, подчас недоступные для других методов, возможности такого подхода. Это, в первую очередь, связано с возможностью проведения с помощью набора флуорохромов комплексного количественного анализа структуры и различных сторон метаболизма живой клетки.

Целый ряд флуоресцирующих соединений (как внутриклеточной природы, так и вводимых в клетку извне) обладает способностью отвечать изменением параметров собственной флуоресценции на изменение физико-химических свойств окружения. Благодаря этому создается возможность следить за такими параметрами клетки, как электрический потенциал на мембране, концентрация протонов и кальция, вязкость липидного бислоя, подвижность компонентов плазматической мембраны и ее проницаемость, клеточная жизнеспособность, синтетическая активность клетки, состояние ее митохондриального и лизосомального аппарата, содержание некоторых внутриклеточных соединений. Число специально синтезируемых флуорохромов постоянно растет, что позволяет изучать все новые стороны клеточного метаболизма.

С помощью зондового микрофлуориметрического анализа клеток и молекулярной фотобиологии микроорганизмов исследуют механизмы модифицирующего и повреждающего действия на клетки биологически активных факторов различной природы (электромагнитного излучения рентгеновского и ультрафиолетового и видимого диапазонов, изменения силы тяжести, гипоксии и реоксигенации, активных форм кислорода, биологически активных веществ, регуляторных пептидов, ряда фармакологических препаратов, включая фотосенсибилизаторы). На базе проводимых исследований ведется работа по созданию клеточных тест-систем и животных моделей для оценки эффективности биологического действия факторов физической и химической природы и изучению механизмов их действия.

В последние годы флуорохромы все более активно применяются при изучении одиночных клеток. Такой подход, в значительной степени благодаря успешному развитию микрофлуориметрической техники (конфокальная микроскопия и др.), оказывается значительно более информативным, чем флуориметрия клеточных суспензий, и позволяет проводить более тонкий анализ механизмов функционирования клетки, в частности, даже на уровне отдельных внутриклеточных органелл. Следует особо подчеркнуть, что метод дает уникальную возможность для изучения гетерогенности клеток в популяции по исследуемому параметру. С этой целью используются специально разработанные приборы — проточные флуориметры. Важным достоинством микрофлуориметрического метода является также и то, что для проведения исследований требуются минимальные количества биологического материала. Это особенно важно в условиях, когда по тем или иным причинам количества его ограничены, как, например, в случае использования клинического материала в научно-исследовательской работе и при постановке флуоресцентных диагностических тестов, которые получают все более широкое применение в медицине.

Одним из направлений исследований, проводимых с использованием зондового микрофлуориметрического анализа животных клеток, является анализ механизмов модифицирующего и повреждающего действия на клетки (главным образом — иммунокомпетентные) биологически активных факторов различной природы. С использованием разработанного микрофлуориметрического метода определения внутриклеточного рН изучается влияние различных факторов физической и химической природы (и их сочетаний) на функционально- метаболическую активность клеток, состояние их плазматических мембран, систему внутриклеточной рН-регуляции, генерацию ими активных форм кислорода и др. Применение ингибиторов и активаторов различных регуляторных систем клетки позволило углубить представления о процессах, происходящих при этом на клеточном уровне и выявить связь наблюдаемых изменений с состоянием системы внутриклеточной рН-регуляции.

Особое внимание в последние годы уделяется изучению механизмов повреждающего действия на клетки Н2 О2 - индуцированного окислительного стресса и защиты от него с помощью факторов различной природы (лекарственные препараты семакс и мексидант, внутри- и внеклеточный рН и др.).