Биофизика клетки и мембранных процессов

А.Б.Рубин, О.Р.Кольс, Т.Е.Кренделева и др.

Разнообразие живых систем во многом определяется многообразием структуры и функции клеточных мембран. Они не только формируют клетку и внутриклеточные структуры, отделяют клетку от внешней среды, защищают ее от проникновения патогенных и чужеродных соединений, но и играют роль селективного, тонко регулируемого, барьера. Кроме того, мембраны — ключевой элемент в генерации электрических импульсов, осуществлении межклеточных контактов, преобразовании и запасании в форме АТФ энергии света и окислительно-восстановительных реакций, а также в регуляции процессов секреции, повреждения и старения клетки. Мембранные рецепторы обеспечивают восприятие света, химических медиаторов, механических стимулов, температуры, электрического поля и др. Чем меньше размеры клеток, тем больше их удельная поверхность и тем более важную роль играют мембраны в жизнедеятельности клетки. Все эти процессы и явления, механизмы их взаимодействия и регуляции составляют важный раздел современной биофизики клетки.

Первичные физико-химические молекулярные процессы

На кафедре проводятся исследования процессов генерации и проведении возбуждения в нервных клетках (нейрон, глиальная клетка и аксон). Изучается состояние плазматических мембран и основные процессы ионного транспорта. Выявлены изменения ряда параметров, характеризующих состояние плазматической мембраны (мембранный потенциал, содержание мембраносвязанного Са2+ , ритмическое возбуждение), субклеточных органелл (потенциал внутренней мембраны митохондрий, содержание восстановленных флавопротеинов, вязкость мембран) и цитоплазмы (изменение показателя преломления) пейсмекерного нейрона при действии нейромедиаторов. Процессы перераспределения Са2+ между плазматической мембраной и внутриклеточными органеллами в пейсмекерном нейроне исследуют при термо-, хемо- и механостимуляции локализованных в коже экстерорецепторов и при воздействии нейромедиаторов и NO на нейрон в составе ганглия. Установлено, что изменения электрической активности нейронов при стимуляции экстерорецепторов и действии нейромедиаторов сопровождаются перераспределением Са2+ в цитоплазме: десорбцией Са2+ , связанного на плазматической мембране клетки, увеличением концентрации Са2+ в цитоплазме, входом Са2+ в митохондрии и стимуляцией работы электрон-транспортной цепи, а также связыванием Са2+ субклеточными структурами и регулярными изменениями оптической плотности цитоплазмы.

Развиваемое направление непосредственно связано с нейрофизиологией и физиологией крови, цитологией, а также нейрохимией, молекулярной биологией и моделированием. Эти работы имеют важное практическое применение в рамках медицинской биофизики. Основным подходом данных исследований является работа на нативных (то есть находящихся в природном состоянии) функционирующих объектах — изучение биоэлектрогенеза, переноса кислорода эритроцитами и др.

Применяются микроэлектродные методы («пэтч-клямп»), методы микроскопии (флуоресцентная микроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния, интерференционная микроскопия, конфокальная микроскопия), а также радиоспектроскопия (ЭПР, ЯМР) и изотопные методы.

Мембранные процессы в растительной клетке

Работы нацелены на изучение электрохимических и фотобиологических процессов, протекающих в хлоропластах и на плазмалемме клетки в индукционный период фотосинтеза и на стадии стационарного фотосинтеза. Изучается фотогенерация мембранного потенциала Δφ в хлоропластах. Наиболее быстрые изменения мембранного потенциала (от 10 мкс до 1 с), протекают на тилакоидных мембранах хлоропластов. С использованием уникально крупных хлоропластов печеночного мха Anthoceros установлено, что мембранный потенциал, наряду с градиентом рН (ΔpH), играет важную роль в биоэнергетике в качестве движущей силы для синтеза АТФ. Измерения Δφ позволяют оценивать проводимость тилакоидных мембран и сопрягающего фактора.

Электрический потенциал тилакоидов оказывает существенное влияние на фотосинтетический перенос электронов, что проявляется в изменениях флуоресценции хлорофилла одиночных хлоропластов при сдвигах Δφ за счет пропускания тока через микроэлектрод. В зависимости от редокс-состояния первичного акцептора электронов в фотосистеме II (ФС II), биполярные импульсы тока вызывают симметричные или асимметричные сдвиги флуоресценции. Предложена математическая модель, объясняющая влияние Δφ на флуоресценцию хлоропластов. Явления возбудимости отвечают за быстрое закрывание листьев у сейсмочувствительных (мимоза) и ряда насекомоядных растений. Потенциалы действия (ПД) возникают и в проводящих пучках многих высших растений в ответ на механические и температурные стимулы. Вместе с тем, исследования на Anthoceros показали, что импульсы типа ПД могут возникать в ответ на короткое (3 с) яркое освещение. Генерация импульсов исчезает при подавлении фотосинтеза и активности H+ - АТФазы растительной клетки. Генерация ПД под влиянием импульса света сопровождается длительными (10—15 мин) изменениями в состоянии фотосинтетического аппарата.

Светозависимая пространственная самоорганизация потоков H+ и активности фотосинтеза наблюдается в клетках харовых водорослей, удобных для исследования многих фундаментальных биологических процессов, поскольку они совмещают способность к фотосинтезу с электровозбудимостью и способностью формировать кальциевые отложения. У неосвещенных клеток водоросли Chara (длина одной клетки которых может достигать 10 см) профиль рН среды однороден по длине клетки, однако на свету в профиле pH возникают чередующиеся кислые и щелочные зоны с перепадом рН порядка 3-х единиц. Неоднородный профиль рН отражает гетерогенное распределение активных транспортных систем плазмалеммы, он согласован с профилем фотосинтетической активности в слое хлоропластов. Создана математическая модель происходящих процессов.

Недавно установлено, что однократная генерация ПД сглаживает неоднородный профиль рН на период до 10—40 мин в зависимости от интенсивности света и уровня Ca2+ в среде. Влияние короткого электрического сигнала — ПД — аналогично эффекту длительного (20 мин) помещения клетки в темноту. Сглаживание профиля рН обусловлено остановкой H+ - насоса в кислых зонах и снижением H+ - проводимости в щелочных зонах. Генерация ПД вызывает быстрое подавление фотосинтетического переноса электронов, более сильное в щелочных зонах. Анализ световых зависимостей и действия ионофоров говорит о том, что влияние ПД на флуоресценцию хлорофилла и квантовый выход переноса электронов в фотосистеме II обусловлено возрастанием ΔpH на тилакоидной мембране. Нарушение согласованных функций хлоропластов и плазмалеммы под влиянием ПД, вероятно, вызвано почти 100-кратным повышением в цитоплазме уровня Са2+ , являющегося регулятором многих внутриклеточных процессов.

Проницаемость клеточных мембран для малых незаряженных молекул (неэлектролитов) и газов

Хотя давно высказывались предположения о том, что в клеточных мембранах существуют поры для просачивания воды, длительное время преобладало мнение, что она просто диффундирует через клеточную мембрану. В конце 1950-х годов было установлено, что в мембранах эритроцитов есть специальные каналы, через которые вода проходит, а ионы — нет. При этом клеточный «водопровод» обладает потрясающей пропускной способностью: до миллиарда молекул воды в секунду. Логично было предположить, что, как и в случае других веществ, например сахаров и аминокислот, транспорт воды через мембрану происходит с помощью белка. Но какой именно белок выполняет данную функцию? Этот вопрос довольно долго оставался без ответа.

Отсутствие заряда у частиц существенно затрудняет исследование их трансмембранного транспорта, и до последнего времени транспорт неэлектролитов оставался наименее изученным. Недавно было показано, что мембранный белок аквопорин образует в мембране водную пору, непроницаемую для ионов. Пространственная структура аквапорина напоминает цилиндрический канал, по которому движутся молекулы воды. Аминокислоты в белке расположены таким образом, что полярность создаваемого ими электростатического поля «переключается» в центре молекулы на обратную. Поэтому молекулы воды, дойдя до середины канала, переворачиваются так, что их дипольные моменты в верхней и нижней части канала направлены в противоположные стороны. Такое переориентирование предотвращает просачивание через канал ионов. К настоящему времени известно около 200 разновидностей белков водных каналов у растений и животных, в том числе 11 — у человека. Благодаря аквапоринам клетки не только регулируют свой объем и внутреннее давление, но и выполняют такие важные функции, как всасывание воды в почках животных и корешках растений.

Открытие аквапоринов стимулировало интерес к чрезвычайно важной проблеме функционирования клетки — механизмам трансмембранного транспорта молекул простых газов и других малых незаряженных молекул. Прежде всего это касается молекулярного кислорода и его синглетно возбужденной формы, а также СО2 , CO, NO, NH3 и др. Постоянный и интенсивный транспорт кислорода через клеточные мембраны — яркая особенность аэробной жизни, обусловленная в первую очередь его необходимостью для процессов дыхания и окислительного фосфорилирования. До последнего времени господствовало мнение, что диффузионное сопротивление липидного бислоя для кислорода практически не отличается от сопротивления слоя воды аналогичной толщины, и его трансмембранный транспорт осуществляется путем простой диффузии.

В последние годы на кафедре биофизики развернуты систематические исследования мембранного транспорта малых незаряженных молекул и, в первую очередь, кислорода. С помощью специально разработанного прямого метода измерения трансмембранного потока кислорода было установлено, что диффузионное сопротивление липидных слоев для кислорода на два — три порядка выше, чем ранее полагали. Это связано с существованием кислородных каналов в клеточных мембранах, осуществляющих интенсивный кислородный транспорт. Прежде всего, это относится к мембранам эритроцитов, содержащих значительное количество аквапорина.

Найдены условия, при которых интенсивность потока кислорода определяется диффузионным сопротивлением мембраны эритроцитов, а диффузионное сопротивление водной фазы, окружающей клетку, минимизируется. Установлено, что диффузионное сопротивление мембраны эритроцитов для кислорода существенно меньше, чем можно было ожидать в условиях простой диффузии через липидный бислой. Ингибирование каналов аквапоринов приближает диффузионное сопротивление мембран для кислорода к сопротивлению липидного бислоя.

Диапазоны действующих концентраций и величины наблюдаемых эффектов торможения потоков кислорода и воды совпадают. Это означают, что канальный транспорт кислорода и воды в мембранах эритроцитов имеет общую природу. Получены доказательства важной роли мембранного транспорта кислорода в физиологии газообмена человека, в частности, при больших физических нагрузках и различных заболеваниях.

Проблемы клеточного анабиоза

Способность к переходу в анабиоз (состояния организма, при котором жизненные процессы настолько замедлены, что отсутствуют видимые проявления жизни) присуща многим живым системам. Это состояние обычно для низших растений (мхи, лишайники), покоящихся спор микроорганизмов и семян высших растений. Семена растений представляются удобным объектом для изучения анабиоза. При анабиозе в клетках семян происходят деструктивные процессы, которые, в конце концов, приводят семена к гибели. Эти процессы протекают достаточно медленно, на что указывает возможность длительного (годы, десятилетия, и даже столетия) сохранения семенами жизнеспособности.

Оказалось, что в семенах медленно развиваются свободно-радикальные процессы деструкции и сшивки макромолекул. Продукты перекисного окисления (перекиси и альдегиды) участвуют в необратимых сшивках белков, липидов и нуклеиновых кислот. При этом наблюдается слабое свечение воздушно-сухих семян, являющееся фосфоресценцией при комнатной температуре.

Проведенные на семенах бобовых культур исследования позволили разработать метод оценки качества индивидуальных семян. Показано, что в каждой партии семян можно выделить три фракции — сильные (I), ослабленные (II) и мертвые (III). Распределение семян по трем фракциям может изменяться в ходе хранения и при различных воздействиях (УФ, ионизирующая радиация, гипертермия и др.). Вещества, тормозящие перекисное окисление липидов (эндогенные антиоксиданты, амидогуанин и др.) продлевают сроки хранения семян. Семена перспективно использовать и в качестве модели при исследовании общей проблемы старения.

Важным фактором жизнедеятельности является вода, на долю которой приходится основная часть содержимого живой клетки; она является прекрасным полярным растворителем, а также стабилизатором биологически важных структур, хотя ее роль этим не ограничивается. Поэтому чрезвычайно важным являются как фундаментальные, так и прикладные проблемы изучения роли воды в биологических процессах. Исследования, выполненные на модельных и биологических системах, привели к выводу, что вода во многом определяет равновесие сил в пределах макромолекул, мембран и других систем. Отражением этого равновесия сил является динамическая структура белков и мембран. Именно с динамикой белков и мембран связана эффективность многих биологических процессов. Оказалось, что макромолекулы ферментов характеризуются более интенсивным внутренним движением по сравнению с неферментными белками. Это, возможно, связано с более жесткими требованиями к процессам регуляции в случае ферментов, где не только сам субстрат, но и продукты его реакции не должны оказаться токсичными для организма.

Особенности динамической структуры биополимеров играют важную роль и на клеточном уровне организации. Здесь изменение динамики в процессах сорбции-десорбции белков приводит к заметному изменению числа степеней свободы и энтропии системы и, соответственно, к малому изменению свободной энергии в подобных процессах. В результате появляется еще один связанный с водой важный механизм управления биологическими процессами с помощью слабых воздействий. Связь между резкой активацией метаболизма и появлением воды в жидкой фазе была четко показана при изучении изменения состояния воды в ходе набухании семян растений.

Решающую роль в жизнеспособности живой клетки играет подвижная вода. Проводимые на кафедре исследования позволили обнаружить неизвестный ранее механизм удержания подвижной воды. Для более чем 100 видов и штаммов грибов, мхов и лишайников с помощью метода ЯМР было показано, что в воздушно-сухих клетках устойчивых к потере воды видов всегда сохраняется некоторое количество подвижной свободной воды. У неустойчивых форм, в том числе у разных штаммов одного вида, такая вода обычно отсутствует. Обычно у устойчивых форм ее количество составляет порядка нескольких процентов, а у криптококков, обитающих в условиях высокогорных пустынь Восточного Памира с резкими колебаниями температуры и влажности в течение суток, количество подвижной воды достигает 30% от веса воздушно-сухой биомассы.