Общая характеристика метода проточной цитометрии

ВВЕДЕНИЕ
Метод проточной цитометрии становится все более актуальным и востребованным на сегодняшний день. В клинической практике проточную цитометрию используют в иммунологии, онкологии, онкогематологии (включая диагностику, оценку эффективности лечения, мониторинг пациентов, входящих в группу риска), трансплантологии, общей гематологии - для диагностического типирования клеток. Постоянно увеличиваются возможности анализа различных параметров клеток, их морфологии, клеточного цикла, функциональные возможности по автоматизации и ускорению анализа. Этому способствует технический прогресс, появляется новая аппаратура, и повышается её доступность, а так же постоянно совершенствуется реагентная база.
Первый патент на устройство, которое легло в основу проточной цитометрии, использующее принцип сопротивления Коултера было зарегистрировано в США в 1953 году, его автор Wallace H. Coulter. Адсорбционные методы на тот момент были распространены гораздо шире флуоресцентных.
Первый проточный цитометр, использующий флуоресценцию (ICP11), сконструировал в 1968 году Вольфганг Гёде (Wolfgang Göhde) в университете германского города Мюнстера и почти сразу получил коммерческое использование немецким разработчиком и изготовителем Партеком (Partec) в Геттингене. Новый метод быстро получил свое признание и развитие, и в период 70 х годов появилось несколько инструментов для проточной цитометрии включая Cytofluorograph (1971) от Bio/Physics Systems Inc., PAS 8000 (1973) от Partec, первые FACS оснащают датчиками от Becton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) от Partec/Phywe и Epics от Коултера (1977/ 78). Изначально методику называли пульсовой цитофлоуметрией. Только 20 лет спустя в 1988, на Конференции американского Технического Фонда в Пенсаколе, штат Флорида, название было изменено на "проточную цитометрию", и именно этот термин быстро стал популярным.
ПРИНЦИП МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Проточная цитометрия - это метод, основанный на измерении светорассеивания и специфической флуоресценции клеток (частиц) при освещении их лазером (ртутной лампой). 
Основа метода заключается в:
1) использовании системы гидродинамической фокусировки либо микрокапилларной системы, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке;
2) облучении клетки лазерным излучением;
3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.
 Поскольку клетки рассеивают лазерный свет в различных направлениях, то свойства клеток, такие как их относительный размер и сложность структуры цитоплазмы, могут быть измерены. В цельной крови человека лимфоциты, моноциты, и гранулоциты могут быть различимы друг от друга просто потому, что рассеивают лазерный свет различным образом.
Рис.1 Типичный профиль светорассеяния лизированной цельной крови
Уникальным атрибутом проточной цитометрии является то, что флуоресценция на клеточном уровне или уровне частиц может быть измерена очень быстро. Когда флуоресцентно меченные клетки или частицы проходят через луч света, флуоресцентные зонды возбуждаются. Обнаружение испускаемого света и, в конечном счете, определенных клеточных свойств происходит со скоростью 10000 событий / секунду.
Рис.2 Спектры возбуждения и испускания для флуорохромов VioBlue®, FITC, and APC.
Сплошные линии: спектр возбуждения
Площадь залитая цветом: спектр испускания
FITC = Максимум возбуждения (Ex):495 нм, максимум эмиссии (Em):519 нм
APC = Максимум возбуждения (Ex):650 нм, максимум эмиссии (Em):660 нм
VioBlue = Максимум возбуждения (Ex):400 нм, максимум эмиссии (Em):452 нм
Проточная цитометрия используется как в клинических, так и в фундаментальных исследованиях: иммунология, трансплантация, гематология, неврология, исследования стволовых клеток, онкология, клеточная биология, молекулярная биология, разработка лекарственных препаратов, системная биология, морская биология, микробиология, вирусология и многие другие. 2.ПРИНЦИП РАБОТЫ ПРОТОЧНОГО ЦИТОМЕТРА
Проточный цитофлуориметр – это прибор, позволяющий измерять оптические свойства индивидуальных клеток в суспензии.
Проточный цитометр состоит из трех основных блоков: жидкостного, оптического и блока обработки электронного сигнала.
Рис.3 Пятипараметрический проточный цитометрЖидкостной блок.
Гидросистема транспортирует смесь клеток таким образом, что клетки выстраиваются поодиночке. Внутри проточного цитометра суспензия, состоящая из одиночных клеток, проходит через определенный участок, где каждая клетка по очереди облучается источником равномерного света в точке наблюдения. В большинстве приборов используется проточная ячейка, вкоторой после введения образца клеток через порт ввода происходит помещение потока клеток в центр потока изотонической по отношению к клеткам «обжимающей» жидкости так, что поток клеток в центре не смешивается с окружающей его обжимающей жидкостью. Это достигается использованием конического соплового аппарата с такими геометрическими параметрами, которые позволяют получать ламинарный поток жидкости, что является важнейшим условием корректности измерения. Диаметр потока клеток регулируется за счет давления проточной жидкости – чем меньше это давление, тем шире поток клеток, и наоборот. Разность давлений между потоком клеток (более низкое давление) и потоком «обжимающей» жидкости (более высокое давление) выталкивает клетки/частицы наружу друг за другом. Затем отраженный или испускаемый клеткой световой сигнал измеряется и анализируется.
Оптический блок.
После окрашивания клеток флуоресцентными красителями или флуоресцентно мечеными антителами свет, излучаемый лазером, взаимодействует с флуоресцентными красителями и вызывает вынужденное излучение когерентных (параллельных) волн света с одинаковой длиной волны, фазой и поляризацией. Диаметр лазерного луча в точке фокуса составляет около 20 мкм вдоль проточного канала и 60 мкм поперек него, что обеспечивает быстрое пересечение клеткой пучка (при этом в пучке одновременно находится только одна клетка) и достаточно равномерное освещение по всей ширине потока клеток. Флуоресцентные сигналы, появляющиеся в результате взаимодействия лазерного излучения с клетками, фиксируются детекторами, ориентированными по ходу лазерного луча, а также перпендикулярно к нему. Наиболее популярными среди лазеров (с соответствующими длинами волн) для проточной цитометрии являются: аргоновый лазер, излучающий свет в синем диапазоне (488 нм), красный диодный лазер (635 нм) и фиолетовый лазер (405 нм).Блок обработки электронного сигнала и вывод данных.
При прохождении клетки через оптическую систему проточного цитометра рассеивание света или флуоресценция, вызванные каким-либо флуорохромом, находящимся на поверхности или внутри клетки, обнаруживаются различными фотодекторами или фотоэлектронными умножителями (ФЭУ), которые преобразуют информацию о характеристиках клетки в обработанную компьютером запись. Каждая анализируемая клетка создает событие для каждого измеряемого параметра (прямое светорассеяние, боковое светорассеяние, интенсивность флуоресценции в соответствующем детекторе). Различные типы клеток демонстрируют определенные наборы сигналов для различных параметров. Когда клетка проходит через луч света, то свет, рассеиваемый в прямом направлении (как правило, под углом примерно 20° к прямому ходу лазерного луча), называется прямым светорассеянием и регистрируется детектором, который называется детектором прямого светорассеяния (FSC). Интенсивность рассеянного в этом направлении света пропорциональна размеру клетки.
Отражение лазерных лучей происходит как от поверхности ядер клеток, так и от различных внутриклеточных структур. Свет, рассеиваемый под углом 90°, называется боковым светорассеянием и регистрируется соответствующим детектором (SSC). Этот параметр отражает оптическую плотность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки. Регистрация бокового светорассеяния позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки, связанной, например, с наличием гранул, шероховатостью мембраны или особенностями ядра, которые приводят к увеличению интенсивности бокового светорассеяния.
Электрические импульсы, преобразованные из световых сигналов, зарегистрированных ФЭУ, обрабатываются при помощи ряда линейных и логарифмических усилителей.
3.РЕГИСТРИРУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ
1. Прямое (малоугловое) светорассеяние.
Детектор прямого светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение лазера, которое рассеивается под углами 2-19 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких.
2. Боковое светорассеяние.
Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа.
3. Регистрация флуоресценции.
Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флюорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной задачей для данного исследования. Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI) флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1).
4. Сортировка клеток.
В проточном цитометре, оборудованном системой для сортировке клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданной частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержится внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку.
4. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ
Оптическая система проточного цитофлуориметра включает один или несколько монохроматических лазерных источника света и систему детектирования сигнала.
При прохождении клеткой лазерного луча происходят следующие события:
1) часть света рассеивается клеткой;
2) часть энергии света поглощается и расходуется в тепло, на протекание фотохимических процессов, либо вновь высвечивается в виде света (флуоресценция), как правило, с меньшей энергией кванта;
3) часть света проходит без изменения, не взаимодействуя с клеткой.
Для анализа свойств клеток используются процессы 1) и 2), при этом в последнем случае анализируется флуоресценция.Анализ прямого светорассеяния. Детектор прямого светорассеяния (FSC, от англ. “forward scatter”) располагается по ходу лазерного луча и собирает излучение, рассеянное в пределах малых углов (2-16°, значения зависят от модели прибора). Центральная часть FSC-детектора экранирована, поэтому нерассеянное лазерное излучение им не регистрируется. В отсутствие клеток или других частиц лазерный луч попадает на экранированную часть детектора. При прохождении клетки через лазерный луч часть излучения рассеивается и попадает на боковые части детектора. Зарегистрированный сигнал преобразуется детектором в электрический импульс, величина которого пропорциональна количеству попавшего на детектор света.
Появление сигнала FSC свидетельствует о прохождении какого-либо объекта через лазерный луч и используется для подсчета количества объектов.
Объекты большего размера, как правило, приводят к большей величине малоуглового светорассеяния. В связи с этим, величина FSC-сигнала позволяет косвенно судить о величине объекта (рис. 4 А).
Рис.4 Схема, иллюстрирующая принцип интерпретации данных о светорассеянии объектов:
А – сигнал прямого светорассеяния (FSC) выше от более крупных объектов;
Б – сигнал бокового светорассеяния (SSC) выше от объектов большей гранулярности.
Анализ бокового светорассеяния
Детектор бокового светорассеяния (SSC, от англ. “side scatter”) располагается под углом в 90° относительно направления лазерного луча и собирает излучение, рассеянное в пределах больших углов (75-105°, значения зависят от модели прибора). Рассеяние света под большими углами является следствием многократного преломления и рассеяния луча лазера при прохождении через клетку. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (наличие гранул, везикул, других внутриклеточных включений, соотношение ядро-цитоплазма и т.п.). Объекты более сложной внутренней структуры, как правило, приводят к большей величине светорассеяния на больших углах. В связи с этим, величина SSC-сигнала позволяет косвенно судить о гранулярности объекта (рис. 4 Б ).
Комбинация FSC и SSC позволяет судить о морфологии клетки в целом и даже без анализа флуоресценции является довольно информативной при анализе популяций клеток в образце.
Анализ флуоресценции
Система для регистрации флуоресценции состоит из комплекса дихроичных зеркал, светофильтров и детекторы флуоресценции (FL, от англ. “fluorescence”), каждый из которых регистрирует излучение в строго определенном диапазоне длин волн. Анализ флуоресценции клеток позволяет получить наибольшее количество информации об исследуемом образце, поскольку даже клетки с идентичной морфологией могут отличаться по составу белков и других макромолекул в зависимости от выполняемой функции, стадии клеточного цикла и т.д. Флуоресценция клетки может возникать как за счет собственных химических соединений (автофлуоресценция), так и за счет применения специальных красителей. Применяются красители, специфически связывающиеся с теми или иными структурами и компонентами клеток (например, пропидиум йодид, связывающийся с ДНК) или конъюгаты красителей с моноклональными антителами, специфичными к определенным мембранным и цитоплазматическим антигенам клетки. Подход с использованием антител к мембранным антигенам является наиболее распространенным в проточной цитофлуориметрии.
В простейшем случае, при использовании только одного красителя, интенсивность флуоресценции свидетельствует о количестве сайтов связывания красителя с клеткой: в случае ДНК-специфичного красителя – о количестве ДНК в клетке, в случае антител – об экспрессии соответствующих антигенов на поверхности клетки и т.п. (рис. 5).
Рис.5 Схема, иллюстрирующая принцип интерпретации данных о флуоресценции объектов при использовании нескольких красителей: сопоставление интенсивности сигнала на разных детекторах позволяет выделить в образце популяции клеток с различным сочетанием исследуемых признаков.Одновременное использование нескольких красителей позволяет выделить популяции клеток с различным сочетанием исследуемых признаков (рис. 6). В частности, такой подход является очень важным при анализе содержания в крови различных фракций лейкоцитов, каждая из которых отличается уникальным сочетанием поверхностных белков – кластеров дифференциации. Все антитела с красителями при этом вносятся в суспензию клеток одновременно, но каждая клетка связывается только с антителами, специфичными к экспрессируемым ею антигенам.
Рис.6 Схема, иллюстрирующая принцип интерпретации данных о флуоресценции объектов при использовании нескольких красителей: сопоставление интенсивности сигнала на разных детекторах позволяет выделить в образце популяции клеток с различным сочетанием исследуемых признаковПри выборе красителя для проведения анализа необходимо учитывать, что его оптические свойства должны соответствовать возможностям прибора:
- длина волны хотя бы одного из лазерных источников должна попадать в спектр возбуждения красителя;
- в системе детектирования сигнала должен быть хотя бы один канал FL, позволяющий принять сигнал флуоресценции красителя.
5.ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
В клинической практике наиболее часто проточную цитометрию используют для исследования клеток крови и костного мозга, их антигенного состава, функциональной активности, количества ДНК и РНК, определения уровня внутриклеточной продукции цитокинов, фагоцитарной активности, активности внутриклеточных ферментов («проточная цитоэнзимология»). Также возможно количественное и качественное исследование таких физиологических внутриклеточных концентрация свободных ионов кальция (Fura-2, Indo-1, Fluo-З), уровень окислительных процессов, активация митохондрий, потенциал наружной мембраны клеток, процессы, связанные с апоптозом, и т. д. параметров, как pH (флюоресцеин и 7-гидроксикумарин), концентрация свободных ионов кальция (Fura-2, Indo-1, Fluo-З), уровень окислительных процессов, активация митохондрий, потенциал наружной мембраны клеток, процессы, связанные с апоптозом, и т. д.
Иммунология.
Иммунная система человека состоит из большого количества разнообразных клеток. Проточная цитофлуориметрия в иммунологии позволяет оценить их структуру и функции, то есть провести морфофункциональный анализ.
- иммунофенотипирование (определение типа и функционального состояния) клеток крови;
- определение фагоцитарной активности иммунных клеток;
- идентификация внутриклеточных белков;
- определение степени пролиферативной активности клеток;
- исследование стадий клеточного цикла;
- оценка степеницитотоксичности клеток.
Цитология:
-определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток,
-оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов,
-определение экспрессии поверхностных антигенов,
-анализ стадий клеточного цикла,
-измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны).
Ревматология.
- определение уровня эксперссии HLA-белков
- определение экспрессии рецепторов к цитокинам при проведении антицитокиновой терапии
- иммунологический мониторинг терапии аутоиммунных заболеваний
Гематология.
- анализсубпопуляционного состава клеток крови;
- подсчёт количестваретикулоцитов и тромбоцитов с помощью специфических маркеров;
- оценка последствийрезидуальнойболезни;
- диагностика острого лейкоза;
- обнаружение анеуплоидных клонов (аномальных клеток с нестандартным набором хромосом), выявление степени пролиферативной активности (тенденции к активному делению) анеуплоидных клонов;
- проведение дифференциальной диагностики реактивного лимфоцитоза и лимфопролиферативных болезней;
- диагностика заболеваний лимфопролиферативной этиологии.
- определение и подсчет низкого уровня иммуноглобулинов, связанных с эритроцитами и не опре-деляемых прямым антиглобулиновым тестом у пациентов с гемолизом.
- определение эритроцитарногохимеризма.
- фенотипирование эритроцитов после многочисленных трансфузий.
- оценка перекрестного взаимодействия с тромбоцитами.
- определение комбинации лейкоцитов в продуктах крови.
Онкология:
Одной из важнейших задач в онкологии является дифференцирование клеток по их типу. Принцип анализа по методу проточной цитофлуориметрии в онкогематологии основан на следующем явлении: при обработке пробы специальным флуоресцентным красителем происходит его связывание с белками цитоплазмы. После деления в активно пролиферирующих клетках происходит снижение его содержания в два раза. Соответственно, двукратно уменьшается и интенсивность свечения клеток.
- количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК),
- анализ стадий клеточного цикла,
- выявление анеуплоидного клона,
- определение пролиферативной активности анеуплоидного клона,
- определение специфических маркеров,
- позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска,
- оценка состояния иммунной системы,
- оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов),
- оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.).
Инфекционные болезни.
- измерение фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов,
- мониторинг септического состояния пациентов,
- измерение количества клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза.
- определение пролиферативной активности клеток и др.
Фармакология.
- оценка уровня экспрессии белковых маркеров чувствительности к лечению лекарственными препаратами;
- измерение активности ферментов, входящих в состав клеток;
- изучение действия биоактивных веществ на состояние клеток человеческого организма путём определения стадии клеточного цикла.
Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет: определить плоидность (количество одинаковых хромосомных наборов в ядрах) клеток; произвести анализ любой стадии клеточного цикла; выполнить анализ содержимого протопластов (бактериальных или растительных клеток), а также произвести их сортировку в соответствии с заданными параметрами.В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100--1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.
Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (invivo или invitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.
Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.
6. ОСНОВНЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
Преимущества проточной цитометрии.
- Высокая (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
- Возможность определения клеточныхсубпопуляций.
- Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
- Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
- Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции).
Проточнаяцитометрия является высокотехнологичным методом быстрого измерения характеристик клеток. Проточнаяцитометрия основывается на арсенале флюоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и внутриклеточных процессов. Этим методом исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов. Проточные цитометры обладают высокой чувствительностью и высоким уровнем автоматизации, простотой эксплуатации и имеют небольшие размеры, что позволяет рассматривать их не только как исследовательские, но и как клинико-диагностические инструменты
Преимуществами сортировки клеток на проточном цитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием.
Недостатки:
- вероятность получения ложных (отрицательных) результатов в период ремиссии, а также из-за наличия латентной сенсибилизации;
- высокая стоимость обследования;
- длительное время получения результата теста.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проточная цитометрия базируется на всем арсенале современных цитохимических флуоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток их антигенов и внутриклеточных процессов.
Проточная цитометрия позволяет исследовать многие важные параметры клеточного цикла. Наиболее распространенной задачей, решаемой с помощью данного класса приборов, является идентификация и подсчет клеток, находящихся в различных периодах клеточного цикла.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что метод проточной цитометрии является перспективным направлением, имеет множество преимуществ, функций и обладает высокой чувствительностью и скоростью анализа. Разнонаправленность метода позволяет использовать его в различных современных и значимых клинических направлениях и научных исследованиях. В настоящее время создаются всё более универсальные и многофункциональные цитометры, разрабатываются более мощные системы управления, делая данный метод рациональнее и актуальнее в современном мире, и в частности в медицине.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ И ЛИТЕРАТУРЫ
Луговская С.А., Почтарь М.Е., Тупицын Н.Н Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов.– М., Тверь: Триада, 2005. – 168 с.Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрическогоанализа крови. – М.: МИА, 2004. – 128 с.Chou T., Sano M., Ogura M., Marishima Y., Itagaki H., Takuda Y. Isolation and transplantation of highly purified autologous peripheral CD34+ progenitor cells: purging efficacy, hematopoietic reconstitution following high dose chemotherapy in patients with breast cancer: results of feasibility study in Japan // Brest Cancer. – 2005. – Vol. 12, N 3. – P. 178-188.Claude L., Lobagiu C., Genin C. Enumeration of peripheral lymphocyte subsets using 6 vs. 4 color staining: a clinical evaluation of new flowcytometer// Cytometry, Part B. – 2005. – Vol. 70B. – P. 29-38.Llorente L., De La Fuente H., Richaud-Patin Y., Alvarado-De La Barrera C., Diaz-Borjon A., Lopez- Ponce A., Lerman-Garber I., Jakez-Ocampo J. Innate immune response mechanisms in non-insulin dependent diabetes mellitus patients assessed by flow cytoenzymology // Immunol. Lett. – 2000. – Vol. 74, N 3. – P. 239-244.Luider J., Cyfra M., Johnson P., Auer I. Impact of the new Beckman Coulter Cytomics FC 500 5-color flow cytometer on a regional flow cytometry clinical laboratory servise // Lab. Hematol. – 2004. – Vol. 10. – P. 102-108.Sack U., Scheibe R., Wotzel M., Hammerschmidt S., Kuhn H., Emmrich F., Hoheisel G.,Wirtz H., Gessner C. Multiplex analysis of cytokines in exhaled breath condensate // Cytometry. – 2006. – Vol. 69, Iss. 3. – P. 169-172.
Xian H.-Q., McNichols E., St. Clair A., Gottlieb D.I. A subset of ES-cell-derived neural cells marked by gene targeting // Stem Cells. – 2003. – Vol. 21. – P. 41-49.Xu L., Zha Q., Sun H., Jia Q., Li F., He X. Preparation and characterization of HLA-A*0201 tetramer loaded with IE-1316-324 antigenic peptide of human cytomegalovirus // Cell Mol. Immunol. – 2006. – Vol. 3, N 5. – P. 367-371.
Zidovec Lepej S., Vince A., Raku ic S., Рakovic Rode O., Sonicki Z., Jeren T. Center for disease control (CDC) flow cytometry panel for human immunodeficiency virus infection allows recognition of infectious mononucleosis caused by Epstein–Barr virus or Cytomegalovirus // Croat. Med. J. – 2003. – Vol. 44. – P. 702-706.Хайдуков С.В. Многоцветныйанализ в проточнойцитометрии для медико-биологических исследований: автореф. дисс. ... д-р. мед. наук – М., 2008. – 59 с.
Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Проточнаяцитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине // Медицинская иммунология. – 2007. - №9(4). - С. 373-378.
Хайдуков С.В., Агафонова С.А., Литвинов И.С. Сравнительный анализ фенотипических характеристик наивных Т-клеток и Т-клеток памяти селезенки мышей линии СВА // Биологические мембраны. – 2005. - №22(6). - С. 482-491.
Menon, Vishal; Thomas, Ria; Ghale, Arun R.; Reinhard, Christina; Pruszak, Jan (2014-12-18). "Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types" // JournalofVisualized Experiments. – 2014. - №94. – Р. 96-103.
Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы / Руководство для врачей. - М: ГОЭТАР-Медиа, 2009, - 352 с Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Лолора-младшего Г., Фишера Т., Адельмана Д. Пер. с англ. - М.: Практика, 2000. - 806 с.
Аллергология и иммунология: национальное руководство / Под ред. Хаитова Р.М., Ильиной Н.И. - М.: ГОЭТАР-Медиа, 2009. - 656 с. - (Серия «Национальное руководства»).
Клетки/ под ред. Б. Льюина и др.; пер. с англ. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011 – 951 с.
Ярилин А.А. Иммунология. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010 – 752 c.
Shapiro H.M. Practical Flow Cytometry. – Hoboken, New Jersey, USA: John Willey & Sons, Inc., 2003 – 736 с.
Кудрявцев И.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в экспериментальной биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2012, 192 с.
Robinson JP, Darzynkiewicz Z, Hyun W, Orfao A, Rabinovitch P, editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; 2004.
Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. // Под ред. Хайдукова С.В., Зурочки А.В. Челябинск. Издательство "Челябинская государственная медицинская академия". 2008, 196 С.
Galbraith, D.W. Flow cytometry and fluorescence-activated cell sorting in plants: the past, present, and future / D.W. Galbraith // Biomedica. – 2010 – Vol. 30 (Suppl.). – P. 65–70.Бессмельцев С.С., Козлов А.В., Сясина Т.В., Удальева В.Ю. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ (ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ) // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-1. – С. 33-36;
Зурочка А. В. Цитометрический анализ субпопуляций Т-хелперов (TH1, TH2, TREG, TH17, Т-хелперы активированные) /А. В. Зурочка, С. В. Хайдуков //Медицинская имму-нология. – 2011. – №1.
Купрышина Н. А. Проточная цитомет-рия в онкогематологии. Часть 2. Основы и но-вовведения в диагностике острых лейкозов /Н. А. Купрышина, Н. Н. Тупицын //Онкогематология. – 2012. – №4.
Хайдуков С. В. Многоцветный цито-метрический анализ идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии αβ-Tcr и γδ-Tcr /С. В. Хайдуков, А. В. Зурочка, В. А. Че-решнев //Медицинская иммунология. – 2008. – №2-3. – С. 115-124.
Venet F. Clinical review: flow cytometry perspectives in the ICU – from diagnosis of infec-tion to monitoring of injury – induced immune dys-functions / F. Venet, A. Lepape, G Monneret //Crit. Care. – 2011. – V. 15 (5). – P. 231.
Overview of clinical flow cytometry data analysis: recent advances and future challenges /C. E. Pedreira, E. S. Costa, Q. Lecrevisse, J. J. van Dongen et al. //Trends Biotechnol. – 2013. – V. 31 (7). – P. 415-425.