Радиоиммунологический метод

Содержание:
Введение.
1.Общий принцип работы радиоконкурентного анализа.
2. Радиоиммунологический метод.
3. Иммунорадиометрический метод.
4. Радиорецепторный метод и белково-конкурентный метод.
Заключение.
Список литературы.
Введение:
Для количественного определения гормонов, онкомаркеров, фармацевтических препаратов, иммуноглобулинов, инфекционных антигенов и тому подобное с целью диагностики и контроля самых различных патологических состояний (онкология, инфекционные болезни, аллергия, эндокринные нарушения) широко используются радиоконкурентные методы исследования, которые в связи с тем, что все этапы такого анализа проводятся не в организме больного, а в пробирке с биологическим материалом, данные методы получили также название радиотестирования in vitro (с лат. «в пробирке»).
Открытие принципа радиоконкурентного анализа положило начало разработке целого ряда новых методик исследования, основанных на конкурентном связывании определяемого вещества с меченым антигеном или антителом и получивших в связи с этим общее название методов связывания (конкурентное белковое связывание, сатурационный анализ).
Среди методик, основанных на радиоконкурентном связывании выделяют:
радиоиммунологический анализ.
иммунорадиометрический анализ.
радиорецепторный анализ.
белково-конкурентный анализ.
Именно рассмотрению общего принципа радиоконкурентного анализа и в частности указанных выше методик, основанных на данном анализе, посвящена данная работа.
1.Общий принцип работы радиоконкурентного анализа.
Принципиальной основой данного анализа является конкурентное связывание определяемого вещества, называемого немеченым лигандом, и идентичного ему меченого лиганда со специфической связывающей системой (связывающий агент).
Связывающий агент вступает в равноправное взаимодействие как с лигандом (искомым веществом), так и с его меченым аналогом, связываясь, согласно закону действующих масс, с ними в количествах, пропорциональных их исходным концентрациям.
Следовательно, чем выше содержание искомого вещества в пробе, тем меньшая часть его меченого аналога свяжется со связывающим обьектом. Поэтому, зная количество связывающего агента и меченого лиганда, можно рассчитать концентрацию искомого вещества. Обычно комплекс лиганд–связывающая система выпадает в осадок, а несвязанная часть меченого аналога остается в надосадочной жидкости.
С целью обеспечения конкуренции меченого и немеченого лиганда за связывающие места количество меченого лиганда должно превышать связывающую способность агента.
Отделив комплекс антиген–антитело от несвязавшегося лиганда и измерив остаточную радиоактивность пробы, можно определить количество связавшегося меченого лиганда, которое обратно пропорционально содержанию в пробе исследуемого вещества. Для этого одновременно проводится серия анализов определяемого вещества, концентрация которого известна,то есть проводятся стандартные разведения. На основании данной концентрации строится калибровочная кривая, который представляет собой график зависимости изменения связывающей активности пробы от содержания в ней искомого вещества.
Сопоставлением активности исследуемых проб и проб с известной концентрацией искомого вещества можно определить концентрацию последнего.
Таким образом, при проведении любого радиоконкурентного анализа выделяют четыре этапа:
1) смешивание исследуемой пробы с меченым антигеном и антисывороткой в присутствии буферного раствора;
2) инкубация — период времени, в течение которого происходит иммунохимическая реакция (продолжительность этого этапа зависит от вида исследования и может длиться от 1 ч до 2 сут);
3) разделение связанного и несвязанного антигенов;
4) радиометрия проб и математическая обработка данных.
Радиометрические устройства соединяются с компьютером и печатающим
устройством, что позволяет автоматизировать процесс получения конечных
результатов исследования.
Используемые в настоящее время в эндокринологии методы связывания различаются по типу связывающего агента и метки.
2. Радиоиммунологический метод.
Является в настоящее время самым распространённым видом радиоконкурентного анализа, вследствие своей высокой специфичности и простоты в исполнении. Данный метод основывается на выполнении функции связывающего агента специфическими антителами.
Необходимыми компонентами для радиоиммунологического анализа (РИА) являются:
Исследуемая проба, обычно являющаяся отцентрифугированной плазмой либо сывороткой крови, а реже, другими биологическими жидкостями (например, спинномозговая жидкость, моча, слюна).
Меченый антиген — искусственно синтезированный либо полученный биологическим методом гормон или другое биологическое вещество, идентичное определяемому, в которое помещаются метки-радиоизотопы.
Антитела, представляющие собой y-глобулины, получаемые путем иммунизации животных специфическими антигенами, аналогичными исследуемому веществу.
Солевые или буферными растворы, предназначенными для поддержания pH системы на протяжении исследования.
Стандарты пробы, содержащие известные, последовательно возрастающие концентрации антигена, необходимые для построения калибровочной кривой
Радиоиммунологическое исследование состоит из 4 основных этапов:
1.Инкубация,осуществляемая при различных температурных режимах.
2.Разделения – комплекс «антиген-антитело» отделяется от непрореагировавших компонентов.
3.Радиометрическое исследование с помощью сцинтилляционных счетчиков.
4.Программный учет результатов.
В настоящее время РИА широко используют для количественного определения гормонов, онкомаркеров, фармацевтических препаратов, иммуноглобулинов, инфекционных антигенов с целью диагностики патологических состояний.
3. Иммунорадиометрический метод.
Иммунорадиометрический анализ (ИРМА) – это метод, в котором используются радиоактивно меченные антитела. Он отличается от радиоиммунологического анализа (РИА) тем, что определяемое вещество немедленно объединяется с радиоактивно меченными антителами, а не постепенно замещает другой антиген в течение некоторого периода.
Принцип действия - при добавлении в пробирки положительного образца, меченные радиоизотопами I125 или I131 антитела связываются со свободными эпитопами антигенов и образуют комплекс «антиген-антитело». Несвязанные меченые антитела удаляются второй реакцией с твердофазным антигеном.
Количество радиоактивного вещества, остающегося в растворе, напрямую зависит от концентрации антигена.
4. Радиорецепторный метод и белково-конкурентный метод.
Принцип данного метода в основе своей не отличается от радиоиммунологического, только субстрат, вместо того чтобы связываться с антителами, реагирует со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля.Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоиммунологического и большинства биологических методов, так как для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию (быть биологически активным),В следствие этого, возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продол­жает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммунологического анализа. То есть антитела и рецепторы определяют различные участки молекулы гормона.
Белково-конкурентный анализ - метод, в котором связывающей системой являются не антитела, а специфические белковые носители гормонов (например, тироксин- или тестостеронсвязывающий глобулин).Так же в основе своей не отличается от радиоиммунологического.
Заключение:
К основным преимуществам РИА и других методов радиоконкурентного связывания относятся их высокая чувствительность, приблизительно равная 10̄12г (для сравнения, чувствительность биохимических тестов не превышает 10-9 г); специфичность, то есть способность системы измерять только одну, строго определенную субстанцию; надежность — способность определять истинное количество вещества; точность, которая заключается в воспроизводимости полученных результатов; доступность для автоматизации всего процесса — от пипетирования до обработки полученных результатов.
Основным организационным недостатком этих методов является необходимость специальной лаборатории для работы с радиоактивными материалами и более дорогостоящей аппаратуры и реактивов, а также целесообразность их применения, по экономическим соображениям, лишь при больших сериях проб, что снижает стоимость исследования и увеличивает эффективность использования аппаратуры. В связи с этим лаборатории, применяющие РИА, должны обслуживать достаточно большое количество лечебных учреждений.

.
Список литературы:
С.Б. Шустов, Ю.Ш. Халимов, В.В. Салухов, Г.Е. Труфанов, Функциональная и топическая диагностика в эндокринологии: руководство для врачей – Москва, ГЭОТАР – Медиа , 2017 г. – 272 с.
Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф. Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев, Иммунодиагностические реакции: учебное пособие – Уфа, ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России , 2016 г. – 84 с.
И. А. Новикова, А. С. Прокопович, Клиническая биохимия. Основы лабораторного анализа: учебное пособие для студентов – Гомель, ГомГМУ, 2011 – 168 с.