Механизмы модификации, мутации, трансформации, трансдукции и конъюгации в микробиологии

Введение
Цель работы – изучить механизмы модификации, мутации, трансформации, трансдукции и конъюгации.
Задачи:
– рассмотреть механизм модификации, понятие модификации и основные виды модификации;
– изучить процесс мутаций, понятие мутаций, выделить основные виды мутаций, определить причины возникновения мутаций, изучить понятие мутагенов, изучить классификацию мутагенов;
– рассмотреть механизм трансформации, изучить основные стадии;
– изучить процесс трансдукции, рассмотреть основные виды трансдукции, определить свойства трансдуцирующих фаговых частиц;
– процесс конъюгации, стадии.
Поставленные задачи будут решены благодаря использованию учебных и справочных материалов по микробиологии, интернет-ресурсов и интернет-изданий, которые посвящены генетике микроорганизмов.
Актуальность темы: результаты изучения генетических аспектов существования микроорганизмов активно применяются в медицине и научной деятельности. Бактерии обладают уникальными генетическими свойствами, что дает микроорганизмам способность размножаться, приспосабливаться и распространяться как в окружающей среде, так и среди живых субстанций. Использование генетических особенностей микроорганизмов применяется при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, также для получения новых лекарственных препаратов, антибиотиков, инсулина, вакцин и т.д.
1 Механизмы модификации
Модификации – это фенотипические ненаследственные изменения одного или нескольких признаков микроорганизма.
Признаки модификаций:
– контролируются геномом;
– их возникновение не сопровождается изменением первичной структуры ДНК;
– вскоре утрачиваются.
Модификации также можно назвать адаптивными реакциями, как отдельных микроорганизмов, так и всей популяции в целом, так как они способствуют приспособлению организма к постоянно изменяющимся условиям окружающей среды за счет выработки адаптивных ферментов.
Модификации проявляются в виде изменения морфологических, биохимических, ферментативных, культуральных свойств (например, стафилококки без пигмента при недостатке кислорода) и других признаков с последующим их возвратом к исходному фенотипу после устранения действия фактора, который вызвал их образование, так как необходимость сохранения этой модификации отпадает.
Выделяют следующие виды модификаций:
– биохимические;
– антигенные;
– морфологические.
Биохимической основой модификации является синтез ферментов в результате индукции и репрессии соответствующих структурных генов, которые контролируются регуляторными генами. Например, кишечная палочка будет только в присутствии лактозы синтезировать ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина будут синтезировать фермент, разрушающий этот антибиотик.
К модификациям также относится включение «молчащих генов», в ходе чего происходит смена антигенов в процессе инфекционного заболевания.
Модификации могут также включать запрограммированные изменения в генетической информации, которые основаны на миграции гена на хромосоме и его встраивании с различной частотой в определенные локусы, что приводит к изменению признаков. Существует также механизм возвращения гена к его первоначальной локализации, что приводит к восстановлению этого признака. К модификациям такого типа относят изменения антигенной структуры гонококков, бледной трепонемы, возбудителя брюшного тифа, боррелий и холерного в вибриона.
Модификации также могут происходить под действием антибиотиков, таких как пенициллин. При этом образуются L-формы бактерий, которые не имеют клеточной стенки, но которые могут сохраняться и размножаться внутри клетки-хозяина и вновь возвращаться к исходной форме после прекращения воздействия пенициллина. При выращивании большинства бактерий на питательной среде с суббактериостатическими концентрациями антисептиков также могут быть получены их модификации, характеризующиеся изменением морфологических или иных признаков.
Типичное проявление модификации – разделение однородной популяции на два или несколько типов. Данный феномен был впервые исследован Вейлем и Феликсом в 1917 году. Де Крайф обозначил этот процесс, как диссоциация микробов.
Обычно диссоциация происходит в неблагоприятных для исходной популяции условиях (например, при высокой концентрации ионов, при избыточно щелочной среде, при неоптимальной температуре), при старении культуры (при длительном хранении), при действии агентов, бактериофагов, антисывороток.
В свою очередь, простые проявления модификации – это изменение вида и структуры бактериальных колоний на твердых питательных средах и особенностей роста в жидких средах. Для того чтобы обозначить диссоциирующие колонии, Аркайт предложил использовать первые буквы английских слов:
– S-колонии (с английского «smooth» – гладкий);
– R-колонии (с английского «rough» – грубый, шероховатый);
– М-колонии (с английского «mucoid» – слизистый);
– D-колонии (с английского «dwarf» – карликовый).
Диссоциация происходит в направлении от S к R, а иногда посредством образования промежуточных М-колоний. Обратная диссоциация (в направлении от от R к S) происходит довольно редко. В свою очередь, большое количество патогенных бактерий образует S-колонии (за исключением возбудителей туберкулёза, чумы, сибирской язвы и некоторых других).
Диссоциация также происходит с изменением биохимических, ферментативных, морфологически, антигенных и других свойств возбудителей [1] .
2 Механизмы мутации
Информация, которую переносит ДНК, не является стабильной, так как если бы она была стабильной, то любое изменение условий окружающей среды привело бы к исчезновению вида, потому что такие микроорганизмы имели бы «застывший» генотип, так как диапазон реакций на какое-либо вешнее воздействие был бы постоянным. Нестабильность генома вызвана мутациями, а также обменом информации между донором и реципиентом.
Мутации – это передаваемые по наследству структурные изменения генов. При мутациях изменяются участки генома.
Мутации вызываются мутагенами. В качестве мутагенов обычно выступают химические вещества и физические факторы (радиация, ультрафиолетовые лучи). Мутагены вызывают предмутационные повреждения в отдельном фрагменте или фрагментах ДНК, такие повреждения затем переходят в мутацию из-за ошибок в работе репарирующих ферментов или непосредственно в процессе репарации.
По механизму действия выделяют три типа мутагенов:
– действие первого типа мутагенов направлено на изменение первичной структуры ДНК вследствие замены пар оснований;
– действие второго типа мутагенов направлено на вызывание выпадения или вставки оснований (например, акридиновые красители);
– третий тип мутагенов обладает множественными эффектами, он вызывает высокую частоту мутаций, за это данный тип мутагенов получил название «супермутаген»; примером «супермутагенов» могут служить нитрозосоединения.
По характеру проявления выделяют спонтанные и индуцированные мутации.
Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают из-за ошибок репликации, неправильного формирования коплементарных пар оснований, структурного искажения ДНК под влиянием естественных мутагенов. В свою очередь, спонтанные мутации могут способствовать возникновению благоприятных и неблагоприятных изменений.
Уровень спонтанного мутирования – одна мутация на каждые 106 - 107 клеток. Численная доля мутантов в клеточной популяции для разных признаков различна и варьируется в пределах от 10–4 до 10–11. Для конкретного гена частота мутирования составляет величину порядка 10–6, а для определенной пары нуклеотидов 10–8. К примеру, если на среду с антибиотиком посеять миллион бактерий, то можно ожидать, что в ходе спонтанной мутации выживет одна колония.
Несмотря на то, что уровень мутаций в бактериальной популяции для отдельных клеток кажется незначительным, нужно понимать, что популяция бактерий огромна и они быстро размножаются. Из этого можно сделать вывод, что уровень мутаций с точки зрения всей популяции достаточно значителен. Кроме того, мутанты, возникающие спонтанно и устойчивые к действию антибиотика, имеют преимущества в размножении по сравнению с «диким» типом бактерий и быстро формируют стабильную популяцию.
Обратимые мутации (реверсии) возвращают спонтанно мутировавшую клетку в ее первоначальное генетическое состояние. Реверсии наблюдаются с частотой одна клетка на 107-108.
Индуцированные (направленные) мутации появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутагенами (например, химическими веществами, температурой, излучением).
Химический мутагенез
Некоторые химические вещества довольно значительно увеличивают скорость мутации до одной мутантной клетки на 103-104 клеток.
В качестве химических мутагенов выступают:
– аналоги азотистых оснований;
– алкилирующие агенты;
– азотистая кислота;
– интеркалирующие агенты.
Аналоги азотистых оснований (например, бромурацил) включаются в молекулу ДНК и вызывают неправильную вставку основания во время репликации (конкретно бромурацил схож по структуре с тимином, он включается в ДНК в качестве партнера аденина, затем он переходит в енольную форму и распознается полимеразой, как цитозин, что приводит к включению в цепь гуанина вместо аденина).Алкилирующие агенты (например, этилметансульфонат) алкилирует атом азота гуанина.
Азотистая кислота дезаминирует азотистые основания.
Интеркалирующие агенты (акридиновые красители) включаются в ДНК между азотистыми основаниями, в результате чего увеличивается расстояния межу ними. Этот процесс приводит к утрате нуклеотидов или включению дополнительной пары нуклеотидов.
Радиационный мутагенез
Ионизирующее излучение приводит к образованию димеров пиримидина, подавляет жизнеспособность клетки и оказывает мутагенное действие.
В зависимости от последствий мутации могут быть:
– нейтральными;
– летальными;
– условно-летальными;
– полезными.
Нейтральные мутации не влияют на жизнеспособность организма.
Условно-летальные мутации участвуют в процессе подавления активности ферментов, которые необходимы бактериальной клетке для нормального функционирования. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут утрачивать или сохранять жизнеспособность. Например, мутанты, чувствительные к температуре (ts-мутанты), сохраняют способность к синтезу ферментов, которые функционируют при 37°С, но утрачивают способность к синтезу ферментов при 42°С. Однако, у бактерий дикого типа ферменты остаются активными и при 37°С, и при 42 °С.
Летальные мутации приводят к полному подавлению способности синтезировать ферменты, которые жизненно важны для бактериальной клетки. Причинами летальных мутаций являются делеции. Также причиной могут выступать мутации в генах, которые несут информацию о синтезе ДНК-полимераз.
Мутации проявляются в виде потери или изменения морфологических (например, потеря жгутиков, клеточной стенки, капсулы) и биохимических (потеря способности ферментировать углеводы, синтезировать аминокислоты, витамины и т.д.) признаков.Полезные мутации повышают жизнеспособность организма (например, устойчивость к антибиотикам, которая развивается в результате мутации в генах бактерий).
По числу мутировавших генов выделяют генные и хромосомные мутации.
Генные мутации затрагивают изменения одного гена и в большинстве случаев являются точечными.
Для хромосомных мутаций характерно распространение на несколько генов.
Точечные мутации сопровождаются заменой или вставкой пары азотистых оснований в ДНК, в результате чего происходит изменение одного кодона и вследствие этого вместо одной аминокислоты кодируется другая или образуется бессмысленный кодон, который не кодирует ни одну из аминокислот (стоп-кодон). Такие мутации называют «нонсенс-мутациями».
Мутации, которые вызывают вставку или выпадение одной пары азотистых оснований, ведут к изменению всех следующих кодонов. Такие мутации затрагивают только один ген и называются мутациями со сдвигом рамки считывания.
У микроорганизма с точечной мутацией в одном гене может возникнуть вторичная мутация в этом же гене, в результате чего восстановится дикий фенотип. При этом первичную мутацию, которая привела к образованию мутантного фенотипа, называют прямой, а мутацию, которая обеспечила возврат к дикому фенотипу, называют обратной. Процесс возврата может случиться в том случае, если прямое мутационное изменение заключается в том, чтобы просто заменить пару оснований в первично мутировавшем гене. Таким образом, если прямая мутация – это замена пары АТ на ГЦ, то обратная мутация – это результат замены пары ГЦ на АТ.
При истинной реверсии восстанавливается не только фенотип, но и генотип. Восстановление одного фенотипа может происходить и в результате супрессии, то есть в результате подавления мутантного фенотипа, что выражается в коррекции мутационного изменения. Например, если во время первой мутации произошла вставка или потеря пары нуклеотидов в одном из участков ДНК одного и того же гена, а в другом мутация противоположного рода (выпадение или вставка), то правильное считывание информации восстанавливается. Такая супрессия называется внутригенной.
При внегенной супрессии мутации, которые подавляют выражение первичного мутационного изменения, локализуются в так называемых генах-супрессорах, кодирующих синтез транспортной РНК. Мутации в этой форме могут приводить к изменениям в транспортной РНК, в результате чего нужная аминокислота доставляется в синтезированный полипептид. В этом случае восстанавливается фенотип, но не генотип.
Хромосомные мутации – это мутации, которые затрагивают участки или целые хромосомы, изменяя их форму, структуру. Различают следующие виды хромосомных мутаций:
– делеция;
– дупликация;
– инверсия;
– инсерция;
– транслокация;
– фрагментация;
– дефишенси.
Делеция – удаление фрагмента хромосомы в средней ее части (в любом месте, кроме концевого).
Дупликация – удвоение участка хромосомы.
Инверсия – поворот участка хромосомы на 180°.
Инсерция – вставка нового фрагмента в хромосому.
Транслокация – перенос фрагмента хромосомы из одного локуса в другой; объединение двух негомологичных хромосом в одну.
Фрагментация – распад хромосомы на отдельные фрагменты.
Дефишенси – удаление концевого участка хромосомы [2].
3 Механизмы трансформации
Трансформация – это процесс передачи генетического материала реципиенту при помощи изолированной ДНК другой клетки. Клетки, способные воспринимать ДНК другой клетки, называются компетентными.
Состояние компетентности довольно часто совпадает с логарифмической фазой роста. Для трансформации нужно создавать особые условия, например, добавление неорганических фосфатов повышает частоту трансформации.
Механизм трансформации был впервые открыт Ф. Гриффитсом в опытах с авирулентным бескапсульным штаммом пневмококка, который приобрел вирулентные свойства при одновременном введении в брюшную полость белых мышей с убитыми капсульными вариантами этих же бактерий. В дальнейшем было показано, что вирулентные свойства передаются in vitro при обработке авирулентных бескапсульных пневмококков экстрактом убитых капсульных пневмококков.
После О. Эвери, К. Мак-Карти, К. Мак-Леод выявили, что активное начало, которое содержится в экстракте убитых пневмокков, – ДНК, которая определяет его генетические свойства и является носителем генетической информации. Явление трансформации воспроизводится в опытах с различными патогенными и непатогенными бактериями: стрептококками, менингококками и др. Обычно от донорской ДНК к клетке-реципиенту передается только один ген. Это связано с длиной трансформирующегося фрагмента ДНК, который может проникать в клетку-реципиент. Он обычно не превышает 1/100 длины бактериальной хромосомы, то есть включает в себя один или несколько связанных генов. Трансформация эффективно происходит в экспериментах с бактериями одного и того же вида, имеющими разные генотипы.
Трансформация происходит в три стадии:
Первый этап – адсорбция двухцепочечной ДНК на участках клеточной стенки компетентных клеток.
Второй этап – ферментативное расщепление связавшейся ДНК в некоторых случайно расположенных местах с образованием фрагментов с молекулярной массой 1-5∙106 Да.
Третий этап – проникновение фрагментов ДНК с молекулярной массой не менее 5∙105 Да. Проникновение сопровождается разрушением одной из цепей ДНК (последний этап энергозависим). Проникшая цепь ДНК будет рекомбинировать с генетическим материалом клетки-реципиента.
Трансформация – главный инструмент картирования хромосом, так как трансформированные клетки включают в себя различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных признаков (чем ближе расположены гены, тем больше вероятность того, что они оба будут включены в один и тот же участок ДНК) дает информацию о взаиморасположении соответствующих генов в хромосоме [3].

Рис. 1 Трансформация с использованием
отдельной молекулы ДНК
4 Механизмы трансдукции
Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками при помощи умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один или несколько генов.
Выделяют следующие виды трансдукции:
– неспецифическая;
– специфическая;
– абортивная.
В клетках, которые индуцированы бактериофагом, во время сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов могут проникать плазмиды или же фрагменты бактериальной ДНК. Вирусы ограничены в количестве генетического материала в соответствии с объемом головки. Если ДНК бактериальной клетки расщепляется фагом в нетипичном месте, то для того, чтобы освободить место для фрагмента хромосомной ДНК, некоторые участки вирусных ДНК «жертвуются», что приводит к потере некоторых их функций. В этом случае частица фага может стать дефектной. Число аномальных фагов может достигать 0,3% от всей дочерней популяции.
Полученный фаг представляет собой частицу, которая вызывает неспецифическую (общую) трансдукцию. При такой форме трансдукции в клетку-реципиенту могут быть введены практически любые гены.
При неспецифической фаговой трансдукции переносится любой фрагмент ДНК хозяина, а при специфической только строго определенные фрагменты ДНК. Наиболее известным примером специфической трансдукции является трансдукция, осуществляемая фагом. Так как этот фаг в процессе перехода в состояние профага включается в бактериальную хромосому между генами, которые кодируют синтез галактозы и биотина, именно эти гены он может переносить во время трансдукции.
При абортивной трансдукции введенный фрагмент ДНК донора не внедряется в генофор реципиента, а остается в цитоплазме, где его ДНК транскрибируется, но не реплицируется. Это приводит к тому, что при делении клетки он будет передаваться только одной из дочерних клеток, то есть будет наследоваться однолинейно, а затем теряться в потомстве.

Рис. 2 Трансдукция с помощью фагов
Выделяют следующие свойства, которыми должна обладать трансдуцирующая фаговая частица:
– частицы несут только часть ДНК фага, они не являются функциональными вирусами, а скорее являются емкостями, которые переносят фрагменты бактериальной ДНК;
– не способны к репликации;
– трансдуцирующие фаги могут содержать некоторую часть хромосомы хозяина с генами, которые дают бактерии-реципиенту некоторые преимущества (например, гены устойчивости к антибиотикам); такое приобретение бактериями новых свойств называется феноменом лизогении.
– феномен трансдукции может быть также использован для картирования бактериальной хромосомы [4].
5 Механизмы конъюгации
Конъюгация у бактерий была впервые открыта Д. Ледербергом и Э. Тейтумом.

Рис. 3 Процесс конъюгации
Конъюгация бактерий – это передача генетического материала от одной клетки другой путем непосредственного контакта. При этом происходит односторонний перенос генетического материала от донора к реципиенту. Необходимым условием для конъюгации является наличие у донора специфического фактора плодовитости F. У грамотрицательных бактерий обнаружены половые F-волоски, через них происходит перенос генетического материала. Клетки, играющие роль донора, обозначают F+, а реципиенты F–.
F-фактор находится в цитоплазме клеток, причем он не один. При конъюгации происходит перенос только ДНК без РНК и белка.
Первый этап конъюгации – это процесс прикрепления клетки-донора при помощи половых ворсинок к клетке-реципиенту и возникновение между клеткой-донором и клеткой-реципиентом конъюгационного мостика.
При помощи конъюгационного мостика из клетки-донора в клетку-реципиент переходят F-фактор и другие плазмиды, которые находятся в цитоплазме донорной клетки в автономном состоянии.
Для того чтобы осуществить процесс переноса бактериальной хромосомы, нужен разрыв одной из цепей ДНК. Разрыв происходит в месте включения F-плазмиды при участии фермента эндонуклеазы.
В это время проксимальный конец ДНК будет проникать в клетку-реципиент через конъюгационный мостик и сразу достраиваться до двунитевой структуры.
Нить, которая осталась в клетке донора, будет являться матрицей для синтеза второй нити. Отсюда следует, что в процессе конъюгации передается от клетки-донора только одна нить, а вторая, оставшаяся, комплементарная, цепь достраивается в клетке-реципиенте.
Отсюда следует, что переход F-плазмиды в состав бактериальной клетки приводит к процессу разрыва одной из нитей ДНК и это обеспечивает возможность ее переноса в клетку-реципиент.
Штаммы-доноры называют Hfr-штаммами. В процессе скрещивания Hfr-штамма с F-бактериями, F-фактор не передается, так как он располагается в дистальной части хромосомы. Однако с большой частотой передаются гены бактериальной хромосомы, которые расположены вблизи начала переноса – О-точки – вследствие разрыва конъюгационного мостика. При этом F-плазмида будет определять не только О-точку, которая характерная для каждого штамма, но и направление передачи хромосом от клетки-донора к клетке-реципиенту [5] .

Заключение
В ходе проведенного исследования на тему «Механизмы модификации и мутации у бактерий, механизмы трансформации, трансдукции и конъюгации» при помощи учебных и справочных материалов по микробиологии, интернет-ресурсов и интернет-изданий, которые посвящены генетике микроорганизмов, были достигнуты следующие задачи:
– рассмотрены механизмы модификации, понятие модификации и основные виды модификации;
– изучен процесс мутаций, понятие мутаций, выделены основные виды мутаций, определены причины возникновения мутаций, изучено понятие мутагенов, изучена классификация мутагенов;
– рассмотрены механизм трансформации, изучены основные стадии;
– изучен процесс трансдукции, рассмотрены основные виды трансдукции, определены свойства трансдуцирующих фаговых частиц;
– изучен процесс конъюгации, его стадии.
Таким образом, изучение механизмов модификаций, мутаций, трансформаций, трансдукций и конъюгаций, имеет важное практическое значение при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, для получения новых лекарственных препаратов, антибиотиков, инсулина, вакцин и т.д.

Список использованной литературы:
1. Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология / Л.Б. Борисов. – М.: МИА, 2005. – 93 c.
2. Левинсон, У. Медицинская микробиология и иммунология / У. Левинсон. – М.: Бином, 2015. – 52 с.
3. Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: учеб.пособие /О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. – 84 с.
4. Госманов, Р.Г. Санитарная микробиология: Учебное пособие / Р.Г. Госманов, А.Х. Волков, А.К. Галиуллин, А.И. Ибрагимова. – СПб.: Лань, 2018. – 124 с.
5. Коротяев, А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учеб./ А. И. Коротяев. – СПб., СпецЛит, 2008. – 119 с.