Методы культивирования вирусов

Введение
Проблема вирусов актуальна по сей день. А в настоящее время, учитывая современные эпидемиологические условия она стала неотъемлемой частью и жизни и темой обсуждения. Она привлекает внимание огромного числа ученых. В XIX веке, когда впервые стало известно о существовании вирусов, никто и не подозревал, что они будут настолько опасны. Постоянно, множество людей заражаются такими опасными вирусами заболеваниями как СПИД, рак, нельзя не сказать про последнюю «чуму» века – COVID 19. Однако вирусными инфекциями, болеют и растения, и животные, и это тоже проблема человечества, поскольку сельское хозяйство и животноводство в этом случае тоже страдает. Вирусы имеют способность достаточно быстро мутировать и приобретать новые качества, из-за чего регулярно новые, неизвестные науке, вирусы. Этой проблемой занимается отдельная наука – вирусология, которая решает задачи изучения и борьбы с вирусом.
Вирусология сегодня - активно развивающаяся наука, которая использует самые современные открытия и технологии. Её практическое значение для многих сфер медицины, ветеринарии, сельского хозяйства - неоценимо. На вирусах изучаются вопросы генетических биохимических процессов. Учёные всё более глубоко и успешно познают тончайшую структуру, биохимический состав и физиологические свойства этих ультрамикроскопических живых существ, их роль в природе, жизни человека, животного и растений. Развитию вирусологии способствует успехи ученых в молекулярной генетике. Изучение вирусов помогло пониманию структуры генов, расшифровки генетического кода, определению механизмов мутации. Вирусы широко применяются в работах генной инженерии. Способность вирусов приспосабливаться, вести себя непредсказуемо – огромное поле для изучения многих других вопросов.
В своей работе я хочу отразить важные моменты, и способы культивирования вирусов, как «золотого стандарта» выделения и идентификации возбудителя заболевания. Ведь что бы решить главные цели и задачи вирусологии, спасти множество человеческих жизней, уберечь от убытка сельское хозяйство и животноводство, необходимо правильно определить возбудителя. Я расскажу о способах выявления вирусных возбудителей, ознакомлю с основателем вирусологии Д. И. Ивановском и о других ученых, внесших вклад в развитие вирусологии.
Актуальность: миллионы людей во все времена стали жертвами вирусов, как возбудителей различных болезней. И всё-таки многие болезни были преодолены, благодаря успехам вирусологии. В настоящее время главной общемировой проблемой стал коронавирус. Это дает основание думать и утверждать, что в нашем тысячелетии актуальность данной сферы будет только расти и развиваться. А эффективность борьбы с вирусами зависит от правильности выявления конкретного возбудителя.
Цель исследования: идентификация вирусов
Задачи исследования: проанализировать методы диагностики вирусных инфекций, условия забора материала.
Предмет исследования: методы идентификации вирусов.
Методы исследования: анализ литературы, сравнение.
1. Историческая справка
Еще изучая бешенство, Л. Пастер не мог обнаружить его возбудителя и предположил, что наличие мелкого агента проходящего через фильтр Чемберлена. Он предложил другому учёному проверить это предположение на возбудителе чумы, но тот ограничился констатацией фата, что заболевание вызывает мелкий фильтрующий агент. Подлинным открывателем, уже позже, стал Д.И.Ивановский в 1892г., открывший возбудителя вирусной болезни табачной мозаики растений. И лишь немногие ученые того времени оценили важность этого открытия и потребовалось 6 лет для всеобщего принятия концепции Д.И. Ивановского о фильтрующихся ультрамелких инфекционных частицах. Затем подобные агенты стали обнаруживаться при других различных инфекциях. Были открыты фильтрующиеся бактерии: L- формы и микоплазмы. Однако из-за практически полного отсутствия адекватным методов исследования в то время, дальнейшее изучение практически зашло в тупик, так как вирус проходит через бактериальные фильтры, не растут на питательных средах и не обнаруживается в световом микроскопе. Поэтому сами вирусы какое-то время представлялись некими гипотетическими агентами.
В 1898 г. голландский исследователь М. Бейеринк подтвердил основные свойства возбудителя мозаичной болезни, включая его способность проходить через бактериальные фильтры, и использовал для его обозначения термин «вирус» (лат. virus – яд).
В том же 1898 г. Ф. Леффлер и П. Фрош обнаружили фильтрующийся вирус ящура.
В 1901 г. У. Рид с сотрудниками выделили фильтрующийся вирус из органов и тканей людей, умерших от желтой лихорадки.
В 1909 г. К. Ландштейнер и Э. Поппер установили вирусную природу полиомиелита.
Ф. Туорт в 1915 г и Ф. д′Эррель в 1917 г. открыли вирусы бактерий – бактериофаги.
Эти результаты позволили выделить вирусы в совершенно особую группу возбудителей. Они поражают все формы живых организмов, имеющих клеточное строение – от бактерий до человека.
2. Структура вирусов.
Вирусы - наименьшие по размерам агенты, имеющие геном, окружённый белковой оболочкой-. Вирусы не воспроизводятся самостоятельно, они- облигатные внутриклеточные паразиты, репродуцирующийся только в живых клетках. Все вирусы существуют в двух формах: внеклеточной и внутриклеточной.
Внеклеточная форма- вирион- включает в себя все составные элементы (капсид, нуклеиновую кислоту, структурные белки, ферменты и др.).
Внутриклеточная форма- вирус- может быть представлена лишь одной молекулой нуклеиновой кислоты, так как, попадая в клетку, вирион распадается на составные элементы.
В настоящее время известны вирусы бактерий (бактериофаги), грибов, растений и животных.
3.Морфология и размер вирусов.
Вирусы относят к царству Vira. Это мельчайшие микроорганизмы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). Они отличаются особым разобщенным (дизъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки и затем происходит их сборка в вирусные частицы. Вирусы, являясь облигатными внутриклеточными паразитами, размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Сформированная вирусная частица называется вирионом. Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, так как их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методом
ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным–натуральной оспы (около 350 нм)
Несмотря на внутриклеточный паразитизм, среди вирусов имеются крупные виды соизмеримые с микоплазмами и хламидиями. Например, вирус натуральной оспы достигает 400нм и вполне сравним с риккетсиями ( 300-500 нм) и хламидиями (300-400нм). По морфологии выделяют вирусы палочковидные (например, возбудитель лихорадки Эбола) пулевидные (вирус бешенства), сферические (герпесвирусы), овальные (вирус оспы), а также бактериофаги, имеющие сложную форму. При всем разнообразии конфигураций, размеров и функциональных характеристик вирусам присущи некоторые общие признаки. Это зрелая вирусная частица (вирион) состоит из нуклеиновой кислоты, белков и липидов, либо в его состав входят только нуклеиновые кислоты и белки.
Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. имеют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Среди РНК-содержащих вирусов различают вирусы с положительным (плюс-нить РНК) геномом. Плюс-нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию информационной РНК (иРНК). Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным (минус-нить РНК) геномом. Минус-нить РНК этих вирусов выполняет только наследственную функцию. Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде про вирус, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме
инфицированных клеток, напоминая плазмиды. Различают просто устроенные (например, вирус полиомиелита) и сложно устроенные (например, вирусы гриппа, кори) вирусы. У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота связана с белковой оболочкой, называемой капсидом (от лат. capsa–футляр). Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц–капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид, взаимодействуя друг с другом, образуют нуклеокапсид. У сложно устроенных вирусов капсид окружен дополнительной липопротеидной оболочкой–суперкапсидом (производное мембранных структур клетки-хозяина), имеющей «шипы». Для вирионов характерен спиральный, кубический и сложный тип симметрии капсида. Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида, кубический тип симметрии–образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту. Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной. В вирусологии используют следующие таксономические категории: семейство (название оканчивается на viridae), подсемейство (название оканчивается на virinae), род (название оканчивается на virus). Однако названия родов и особенно подсемейств сформулированы не для всех вирусов. Вид вируса биноминального названия, как у бактерий, не получил.
В основу классификации вирусов положены следующие категории:
тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (одна или две);
особенности воспроизводства вирусного генома;
размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;
наличие суперкапсида;чувствительность к эфиру и дезоксихолату;
место размножения в клетке;антигенные свойства и прочие вирусы поражают позвоночных и беспозвоночных животных, а также растения и бактерии. Являясь основными возбудителями инфекционных заболеваний человека, вирусы также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными путями, в том числе через плаценту (вирус краснухи, цитомегаловирус и др.), поражая плод человека. Они могут приводить к постинфекционным осложнениям–развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефицитов и др., кроме обычных вирусов, известны и так называемые неканонические вирусы–прионы–белковые инфекционные частицы, являющиеся агентами белковой природы, имеющие вид фибрилл размером 10.20x100.200 нм. Прионы, по-видимому, являются одновременно индукторами и продуктами автономного гена человека или животного и вызывают у них энцефалопатии в условиях медленной вирусной инфекции (болезни Крейтц-фельдта, Якоба, куру и др.). Другими необычными агентами, близкими к вирусам, являются вироиды–небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие белка, вызывающие заболевания у растений.
4. Взаимодействие вируса с клеткой
Известны три типа взаимодействия вируса с клеткой:
продуктивный тип, завершающийся образованием вирусного потомства;
абортивный тип, не завершающийся образованием новых вирусных частиц, поскольку инфекционный процесс прерывается на одном из этапов;
интефативный тип, или вирогения, характеризующийся встраиванием вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.
Продуктивный тип взаимодействия (репродукция вирусов). Репродукция вирусов (от англ, reproduce–воспроизводить) осуществляется в несколько
стадий, последовательно сменяющих друг друга:адсорбция вируса на клетке;проникновение вируса в клетку;«раздевание» вируса;биосинтез вирусных компонентов в клетке;формирование вирусов;выход вирусов из клетки
Интегративный тип взаимодействия (вирогения) характеризуется встраиванием (интеграцией) нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки. При этом вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома.
5.Лабораторные методы обнаружения вирусов.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
выделение и идентификацию возбудителя;
обнаружение и определение титров противовирусных АТ;
обнаружение АГ вирусов в образцах исследуемого материала;
микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Напомню, что предмет данного исследования — это только культивирование вирусов.
6.Правила забора материала
При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
-образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;
-материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;
-образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно, при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 суток) образцы сохраняют на льду, при более длительной -при температуре минус 50 градусов цельсия.
7.Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя – «золотой стандарт» в диагностике вирусных инфекций. Существует три основных способа и сред для культивирования вирусов: используя культуры клеток, культуры органов куриного эмбриона и животные модели.
7.1. Культуры клеток.
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток – один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличия клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.
7.1.1. Первично-трипсинизированные культуры клеток.
Первично-трипсинизированные культуры клеток – это растущие однослойные культуры клеток, полученные посредством ферментативной дезагрегации органов и тканей. Первичные культуры получают из клеток
различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.
Недостатком первично-трипсинизированных культур является трудоемкость и длительность их получения, а также частая контаминация латентными вирусами. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 недели. Выбор органа и ткани зависит от чувствительности их клеток in vitro к исследуемому материалу. В вирусологической практике нашли применение первично-трипсинизированные культуры фибробластов мышей, эмбрионов человека, эмбрионов кур, почек морской свинки.
7.1.2. Перевиваемые культуры (гетероплоидные культуры) клеток.
Получают из неопластических и нормальных тканей и органов человека или животных. Они имеют измененный кариотип и обладают способностью бесконечно диспергироваться и перевиваться in vitro. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлением первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Перевиваемые культуры клеток в сравнении с первично-трипсинизированными обладают существенными преимуществами: способностью неопределённо долгое время перевиваться, высокой интенсивностью размножения, простой техникой культивирования, возможностью использования сходных штаммов в различных лабораториях, отсутствием инфицированности посторонними вирусами. Многие перевиваемые культуры проведены через сотни серийных пассажей, имеют совершенно одинаковую форму клеток, стабильны в условиях in vitro, что делает их особенно пригодными для выполнения различных экспериментальных исследований. Перевиваемые культуры клеток Hela, Hep-1, Hep-2, почка эмбриона свиньи, почка эмбриона коровы и другие используются для выделения вируса из патологического материала. Перевиваемые культуры выращивают в виде суспензии или однослойных культур на поверхности стекла в культурных сосудах.
Перевиваемые клетки легче получать из злокачественных тканей (клетки Hela получены из карциномы шейки матки женщины, клетки Hep-2 из карциномы гортани человека идр.), но в настоящее время широко культивируются перевиваемые клетки «нормальных» тканей. Однако существует мнение, что перевиваемые ткани «нормального» происхождения вследствие приобретённой потенциальной возможности к бесконечному размножению перерождается.
В вирусологической практике перевиваемые ткани имеют некоторые преимущества: они свободны от скрытых вирусов, тогда, как первичные ткани могут быть носителями латентного вируса; обладают более широким спектром чувствительности к разным вирусам; кроме того, детально изучена их морфология и чувствительность к различным вирусам.
Но перевиваемые клетки имеют ряд недостатков, которые ограничивают в известной степени их применение: они склонны к малигнизации, т.е. к злокачественному перерождению независимо от их происхождения; необходимость постоянного поддержания их; у них появляется неспецифическая дегенерация, изменяется морфология клеток и снижается чувствительность к вирусам. В последние годы в вирусологии, особенно в биопромышленности, применяют штаммы клеток с диплоидным набором хромосом, так называемые диплоидные клетки. Такие штаммы клеток сохраняют хромосомный набор, типичный для исходных тканей. Диплоидные клетки обладают чувствительностью к вирусам, как исходные клетки, свободны от латентных вирусов и не обладают канцерогенными свойствами. Недостаток диплоидных клеток – ограниченная возможность их пассажирования.
Получение субкультур или перевивание клеток проводят следующим образом.
Снятие клеточного слоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путём (соскоб), или воздействием 0,02% раствора версена, или 0,25% раствором трипсина. Из сосудов с выросшим клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют в них подогретый до 37С раствор версена (в количестве вдвое меньшем, чем было среды) и выдерживают в термостате 20-30 минут, при этом сосуд несколько раз покачивают. Версен связывает двухвалентные катионы магния и кальция, в результате ткань разделяется на отдельные клетки и отслаивается от стекла.
Отделение клеток от диспергирующего вещества. Взвесь клеток в диспрегирующем веществе (в версене) помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800-1000об/мин в течение 7-10 минут. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Затем берут 1-2 мл клеточной взвеси и подсчитывают клетки.
Посев клеток. После подсчёта клеток в 1 мл исходную клеточную взвесь разводят питательной средой до нужной концентрации. При этом учитывают добавление к общему объему среды стерильной сыворотки крупного рогатого скота в количестве 10%. Подготовленную взвесь вносят при помешивании в специально подготовленную для культивирования клеток посуду и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток в пробирке по 80-100 тыс. в 1 мл; в сосуды с плоской поверхностью – 25-30 тыс. на 1 см полезной площади сосуда.
Засеянные клетки выращивают в термостате при температуре 37С в течение 3-4 суток. Перевиваемые штаммы клеток обычно пересеваются через каждые 6-7 дней.
Заражение клеточных культур вирусом. Проводят в стерильном боксе. Перед заражением все клеточные культуры микроскопируют и отбирают пробирки или матрацы только с хорошим, типичным монослоем. Культуры с неполным монослоем, с признаками дегенерации клеток или с нетипичным клеточным ростом бракуют.
В качестве вируссодержащего материала для заражения клеток используют фильтраты (прошедшие через бактерийный фильтр) или свежевзятый (в стерильных условиях) нативный материал с добавлением антибиотиков. Заражать ткани можно пассажным вирусом на культуре ткани. В этом случае используют от культур с типичным для данного вируса цитопатогенным эффектом.
Методика заражения. Из отобранных культур отсасывают или сливают питательную среду. Часть культур (не менее четырёх) оставляют в качестве контроля; в них вносят по 0,1 мл свежей питательной среды без сыворотки. В другие 4-6 пробирок с клеточным монослоем вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала. Все культуры в пробирках (контрольные и опытные) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37С 20-30 минут. Затем в них добавляют по 0,9 мл питательной среды без сыворотки, ставят в термостат и ежедневно наблюдают за ними, сравнивая под микроскопом опытные культуры клеток с контрольными.
Необходимо иметь в виду, что при внесении вируса и при последующем его выращивании пробирки выдерживают в термостате под углом так, чтобы клеточный слой был покрыт питательной средой. Поэтому на пробирках принято делать продольные прямые линии цветным карандашом. Пробирки укладывают всегда линией вверх.
Учёт результатов заражения. В контрольных культурах клеток обычно в течение недели морфологических изменения не отмечают. В опытных культурах
под воздействием вируса видимые изменения в клетках могут наступить уже через 10-12 часов, или через несколько дней, или заметной деструкции клеток не наступит. Всё это зависит от восприимчивости ткани к данному вирусу, свойств и дозы вируса, условий культивирования и т.д. Кроме того, следует учитывать также, что морфологические клетки могут изменяться под воздействием токсических веществ, содержавшихся в исследуемом материале.
Чтобы убедиться в отсутствии действии вируса на клетки или подтвердить специфичность этого действия, а также убедиться в том, что наступившая дегенерация клеток не является результатом действия токсических веществ, из зараженных тканей отсасывают культуральную жидкость и заражают ею свежую культуру ткани, т.е. проводят пассаж. Повторение морфологических изменений в пассажах указывает на наличие и размножение вируса. Если в первом дегенерация клеток наступила, а в пассаже она отсутствует, то предполагают наличие в материале токсических веществ.
Отсутствие каких-либо видимых изменений в клетках в первом заражении и пассажах окончательно не исключает наличие вируса в исследуемом материале, т.к. некоторые вирусы не способны вызывать деструкции клеток.
7.1.3. Полуперевиваемые культуры клеток
Полуперевиваемые культуры клеток – это культуры диплоидных клеток человека и животных. Это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами (стабилизации, активного роста, старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергая спонтанной трансформации. Это морфологически однородная популяция клеток,
стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами (стабилизации, активного роста, старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов. Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).
Культуры диплоидных клеток получают из тканей человека путем серийных пассажей культур клеток, сохраняющих характерную диплоидную конфигурацию хромосом. Преимущество культур диплоидных клеток состоит в высокой чувствительности к различным вирусам.
7.2. Культуры органов
Не все виды клеток способы расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.
Куриные эмбрионы представляет собой удобную и простую модель для выращивания вирусных культур, таких, как например гриппа и кори. Его полости защищены твердой оболочкой и стерильны. Это препятствует проникновению микроорганизмов извне, и развитию спонтанных вирусных инфекций. При выделении вирусов 7-12 дневный эмбрион заражают инфекционным материалом на хорион- аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость (вирусы гриппа, кори, герпеса), либо в желточный мешок.
Наблюдение и учёт результатов. в качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка. Аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления характерных поражений на хорион-аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражения изучают на тёмном фоне.
Выбор методов заражения куриных эмбрионов зависит от биологических свойств исследуемого вируса. В вирусологической практике широкое применение нашло заражение на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость и в желточный мешок.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. Используют 10-12 – дневные куриные эмбрионы, инкубированные в горизонтальном положении. Поверхность яйца дезинфицируют спиртом, 2% раствором йода, прожигают. На скорлупе выпиливают треугольник (5-6мм). Иглой надрывают подскорлупную оболочку. На обнажённую хорион-аллантоисную оболочку пастеровской пипеткой наносят 0,1 мл вируссодержащего материала. Отверстия на скорлупе закрывают парафином.
Заражение в аллантоисную полость. Используют 9-11 – дневные эмбрионы, когда аллантоисной жидкости содержится больше всего. Скорлупу дезинфицируют спиртом, 2% раствором йода, прожигают. Яйцо помещают вертикально тупым концом вверх. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы и через него вводят иглу диаметром 0,5 мм и длиной 5 см на глубину 3-5 см. Инокулируют исследуемый материал в количестве 0,1 мл. Место инъекции закрывают парафином. Яйца инкубируют в вертикальном положении при 35 С 24-72 ч.
Заражение в амниотическую полость. Используют 10-11-дневные эмбрионы, которые близко расположены к воздушному пространству. Заражение производят в затемненном помещении под овоскопом. Тупой конец яйца дезинфицируют, в скорлупе делают отверстие над воздушной камерой. Для
заражения используют иглу диаметром 0,6мм. Материал вводят в количестве 0,1 мл. Отверстие закрывают парафином. Зараженные яйца инкубируют при 37С 24-72ч.
Заражение в желточный мешок. Используют 5-6-дневные эмбрионы, т.к. в этот период желточный мешок имеет самый большой объем. Скорлупу дезинфицируют, делают в ней отверстие. Для заражения используют иглу длиной 5см, которую вводят вертикально до упора. Игла прокалывает хорион-аллантоисную оболочку, проходит через аллантоисную полость и через стенку желточного мешка в желток. Место инъекции закрывают парафином. Яйца инкубируют при 37С 72 ч.
7.3. Животные модели.
Заражение животных возбудителем применяют. Когда другие методы in vitro не способы идентифицировать вирус. После развития инфекционного процесса оценивают типичные симптомы вирусной инфекции и проводят патоморфологическое исследование их органов и тканей для обнаружения и дальнейшего исследования вирусов. Наиболее широко с этой целью используются новорожденные и взрослые мыши, сирийские хомячки, морские свинки, кролики, обезьяны. Например, для выявления вирусов Коксаки заражают мышат- сосунков. Животных заражают интраназально, интрацеребрально, внутрибрюшинно, накожно. Мозг и другие ткани животных часто используются для приготовления вирусных антигенов. Данный метод
отличается свой дороговизной. Поэтому их практически вытеснили клеточные структуры. Однако животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.
8.Особенности генетики вирусов
Геном вирусов имеет простое строение и малую молекулярную массу. Число генов у вирусов колеблется от 4до 6 (парвовирусы) до 150 генов и больше (вирус оспы). В основе изменчивости вирусов лежат мутации. Мутации носят случайный характер или могут быть направленными. Вирус, являясь облигатным внутриклеточным паразитом, реализует этот паразитизм на генетическом уровне. Присутствие нескольких типов вирусов в инфицированных клетках, т.е. смешанная инфекция, может приводить к таким генетическим взаимодействиям между ними, как множественная реактивация, рекомбинация, кроссреактивация и др.; могут иметь место и негенетические взаимодействия–комплементация и др. Множественная реактивация–процесс взаимодействия вирусов с поражением разных генов, в результате которого взаимодействующие вирионы дополняют друг друга благодаря генетической рекомбинации, образуя неповрежденный вирус. Рекомбинация–обмен генетическим материалом между вирусами–возможна в виде обмена генами (межгенная рекомбинация) или участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). У вирусов рекомбинация происходит в процессе заражения двумя или более типами вирусов, отличающимися друг от друга по генетическим признакам. Вариантом рекомбинации является перекрестная реактивация, или кроес-реактивация, происходящая в том случае, когда у одного из штаммов вируса часть генома повреждена, а другой геном нормальный. При смешанной инфекции двумя такими вирусами в результате рекомбинации появляются штаммы вируса со свойствами родительских микроорганизмов. В качестве примера негенетического взаимодействия вирусов может быть приведена
комплементация: при смешанной инфекции стимулируется репродукция обоих участников взаимодействия или одного из них без изменения генотипов вирусов. Комплементация широко распространена среди вирусов и наблюдается между как родственными, так и неродственными вирусами. Обмен генетическим материалом при этом феномене не наблюдается. Если геном одного вируса заключен в капсид другого вируса, этот феномен называется фенотипическим смешиванием, наблюдаемым при смешанной инфекции. Возможны также генетические взаимодействия неродственных вирусов, изучаемые генетической инженерией. Изучение генетики микроорганизмов не только имеет важное биологическое значение, но и способствует решению многих медицинских проблем, таких, как разработка патогенетических основ лечения и профилактики инфекционных болезней, способов диагностики (полимеразная цепная реакция, ДНК-зонды), создание профилактических, лечебных и диагностических препаратов. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического («маркерного») гена возбудителя. Для этого двунитчатую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают») и достраивают к «расплетенным» нитям ДНК новые комплементарные нити, в результате чего из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при различных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит в пробирке (in vitro) при добавлении к амплифицируемым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых ДНК), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.
Заключение
Итак, методы культивирования вирусов являются основой и стандартом в диагностике вирусов. Актуальность данных методов не устарела и достаточно активно применяется и в настоящее время. Для правильной идентификации вирусов необходимо учитывать множество условий, как при заборе материала,
так и при технике культивирования. Необходимо знать особенности строения, химических процессов вируса и так же особенности их генетических мутация. Последнее свойство играет важную роль в опыте определения возбудителя, так как мутации свойственны вирусам как никому среди микроорганизмов. Зная все особенности, приводит к правильности установки возбудителя и к эффективным дальнейшим действиям в отношении их.
Список литературы
1.Воробьёв А.А., Быков А.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. М.: Учебник для СПО/ Москва, Издательство Academia – 2009. – 288 с.
2.Васильев Ю.М., Руднева И.А., Коктяева И.Б. Сравнительное изучение размножения вируса гриппа в культуре клеток и куриных эмбрионах //Вопросы вирусологии. – 2009. - №4. – С. 18-23.
3. Колешко О.И., Завезенова Т.В. Микробиология с основами вирусологии. М.: Учебник для мед. ВУЗов/ Москва, Издательство Academia – 1999. – 287 с.
4.Камышева К.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. Медицина/ Москва, Издательство Феникс – 2009. – 282 с.
5.Поздеев О.К. Медицинская микробиология. М. ГЭОТАР-МЕД - 2004.
6.Мэхи Б. Вирусология. Методы. Москва, «Мир», 1988 г.
7.Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. Учебник для мединститутов. 4-е изд., Москва, Медицина. 1995 г.
8.Медицинская вирусология, под редакцией Д.К.Львова
Издательство: Медицинское информационное агентство , 2008 г.
9.Вопросы общей вирусологии. СПб.:Изд-во СПбЛМА, 2007.
10.Мед. микробиология, вирусология и иммунология. ред. А.А.Воробьев. М.: Мед. информац. агенство, 2008.
11. http://www.who.int/entity/ru/12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/