Общий обзор инструментальных методов исследования в биохимии

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМ. Н. П. ОГАРЁВА»
Факультет биотехнологии и биологии
Кафедра биотехнологии, биоинженерии и биохимии
РЕФЕРАТ
По дисциплине «Методы биохимических исследований»
Тема «Общий обзор инструментальных методов исследования в биохимии»
Выполнил
студент 306 группы
направления 06.03.01 Биология
Кундев Владислав Сергеевич
Проверила
Саранск 2020 г.
Введение
Современные методы исследования позволяют изучать органы и ткани не только как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для изучения их жизнедеятельности в течение длительного времени, выделять отдельные клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы (например, ДНК), исследовать их функциональные особенности.
Такие возможности открылись в связи с созданием новых приборов и технологий – различных типов микроскопов, компьютерной техники, рентгеноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получения гибридов; использования биотехнологических методов – получения гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.
I Оптические методы анализаПри проведении клинико-биохимических исследований наиболее широко используются 2 группы методов: оптические и иммунохимические.
Основными оптическими методами количественного анализа является абсорбционная фотометрия (колориметрия, спектрофотометрия, нефелометрия, атомно-абсорбционная фотометрия), эмиссионная фотометрия (пламенная фотометрия, флюориметрия, атомно-эмиссионный спектральный анализ), рефрактометрия, поляриметрия.
Большую часть исследований в клинической биохимии проводят с использованием методов, основанных на принципе абсорбционной фотометрии.
Абсорбционные оптические методы основаны на способности вещества избирательно поглощать поток световой энергии. Так как в клинической биохимии дело имеют преимущественно с веществом, находящимся в растворенном состоянии, то измеряется обычно светопоглощение раствора или интенсивность окраски, которая зависит от концентрации вещества.
Эмиссионная фотометрия основана на определении концентрации вещества по интенсивности светоизлучения (эмиссии) атомами исследуемого вещества.
Рефрактометрия базируется на измерении показателя преломления света при прохождении через оптически неоднородные среды, а поляриметрические методы – на свойстве прозрачных веществ вращать плоскость поляризованного луча света.
К оптическим измерительным приборам, используемым в клинической биохимии относятся:
1. Фотометры (фотоэлектроколориметры), позволяющие вести исследование в основном в видимой части спектра и определять количество вещества в окрашенных растворах.
2.Спектрофотометры, позволяющие выделять узкие участки спектра и вести определение по величине светопоглощения как в окрашенных, так и не окрашенных растворах.
3.Денситометры, используемые для сканирования, разделенных на носителях фракций анализируемых веществ.
4.Нефелометры, позволяющие определить концентрацию вещества в коллоидных растворах по величине светорассеяния.
5.Флюориметры, используемые для определения концентрации сложных органических веществ по интенсивности флуоресценции.
6.Пламенные фотометры, позволяющие определять содержание металлов в биологическом материале по интенсивности светоизлучения (эмиссии) атомов веществ испаряемых в пламени.
7.Атомные абсорбциометры, позволяющие определять в анализируемых средах содержание элементов по величине поглощения света атомами веществ, испаряемых в пламени газовой горелки.
8.Рефрактометры, дающие возможность определить концентрацию веществ в растворе по показателю преломления.
II Методы биохимииЭти методы очень разнообразны. Биологическая химия, как и любая наука, располагает особенными методами исследования, которые в процессе развития науки изменялись и совершенствовались.
Методы аналитической химии широко использовались и используются в биохимии и в настоящее время.
Метод синтеза в изучении структуры белков позволил выяснить весьма существенное в их строении – способ соединения аминокислот друг с другом (пептидные связи) в молекулах белка и затем выяснить последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидных цепях белковых молекул. В настоящее время удалось установить количество полипептидных рядов в молекулах таких белков, как инсулин - гормон белковой природы, рибопуклеаза – фермент, катализирующий расщепление рибонуклеиновой кислоты, и в некоторых других.
Таким образом, химическая структура некоторого количества белков может считаться изученной настолько, что реально может быть поставлен вопрос о получении их путем синтеза.
В настоящее время достигнуты большие успехи в изучении закономерностей развития органического мира. Биохимия все глубже проникает в молекулярную структуру живой клетки, выясняет сущность протекающих в ней элементарных физико-химических процессов и раскрывает связи химических и физических структур клетки с их биохимическими функциями.
В последнее время особенно активно внедряются в биохимические исследования физико-химические и физические методы: хроматография, электрофорез, рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия, инфракрасная спектроскопия, электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), метод радиоактивных изотопов и т.д. В итоге сформировалась новая область научных знаний -- физико-химическая биология, успешно развивающаяся в нашей стране.
Следует уделить особое внимание методу радиоактивных изотопов, который дает возможность проследить за перемещением того или иного вещества в организме. Этот метод дал возможность расшифровать многие биохимические процессы, которые происходят в отдельных органах. В результате применения меченых атомов выявлена исключительная динамичность белковых веществ. Белки больше, чем какие-либо другие вещества, подвергаются в организме обновлению, распаду и синтезу. Далее было установлено, что постоянному обновлению в известной мере подвергаются составные части таких, казалось бы, инертных образований, как сухожилия, -связки, зубная эмаль и др. Все эти данные в значительной мере расширили наши представления об обмене веществ между организмами и окружающей их средой и поставили перед исследователями ряд новых проблем.
Многие факты, установленные динамической биохимией при использовании бесклеточных соков, отдельных клеточных элементов, митохондрий, макросом, ядер и т. д., были подтверждены изучением химических процессов в целостном организме с помощью метода меченых атомов.
С помощью электронного микроокопа при очень сильном увеличении удалось изучить строение клеток, выявить в них наличие субклеточных образований. Оказалось, что цитоплазма далеко не однородна, как это кажется в обычном микроскопе. В ней имеется ряд специализированных структурных образований, или, как их называют, клеточные органоиды, выполняющие специфические функции: ядро, митохондрии, рибосомы, или микросомы, клеточные гранулы резервного белка или крахмала, капельки жира, которые различаются по размерам и плотности. В клетках растений имеются еще пластиды, содержащие обычно зеленый пигмент хлорофилл.
Крупным шагом вперед явилась разработка способа выделения составных частей клетки, позволяющего получить более или менее однородные и чистые препараты ядра, митохондрий и др. Научились «гомогенизировать» клетки, а затем при помощи высокоскоростных центрифуг отделять митохондрии от других цито-плазматических частиц. Они оседают с разной скоростью, зависящей как от свойств самих внутриклеточных компонентов, так и свойств жидкой фазы гомогената. После этого можно инкубировать in vitro очищенные митохондрии и изучать их метаболические свойства. Изолированные митохондрии способны расщеплять углеводы, жирные кислоты и аминокислоты до углекислоты и воды, т.е. они остаются живыми. В живой клетке митохондрии можно распознать по их избирательному окрашиванию особым красителем – янусом зеленым.
Обычно они сосредоточены в участках клетки с наиболее интенсивным обманом веществ, состоят из белков, рибонуклеиновых кислот и фосфолипидов. В этих тельцах или на их поверхности находится сложный комплекс ферментов, при помощи которых углеводы, жирные кислоты и аминокислоты расщепляются до углекислоты и воды.
В биохимии нашли широкое применение физические методы - метод рентгеноструктурного анализа, при помощи которого выявлена структура сложных соединений – ряда фибриллярных белков, миоглобина, структура лизоцима и других молекул. Физико-химические методы позволили выяснить основные принципы построения биополимеров - белков, нуклеиновых кислот и полисахаридов, а познание молекулярного строения живого позволяет глубоко проникнуть в тайны жизненных процессов.
Акад Энгельгардт подчеркивал, что в основе жизненных явлений лежат три потока - материи, энергии и информации. Эти три потока переплетаются между собой, представляя триаду. Нуклеиновые кислоты обеспечивают поток информации, белок является основой для потока материи и энергии, а поскольку белки обладают и каталитическими свойствами, им принадлежит и решающая роль в обеспечении структурной организации живой материи. В первую очередь здесь имеется в виду синтез специфических белков, играющих роль пластического материала и регуляторов метаболизма клетки, так как все ферменты являются белками. Биологическая специфичность различных белковых веществ обусловлена главным образом последовательностью распределения 20 аминокислот в белковых молекулах животных и растений.
III Иммунохимические методы в клинической биохимииВ клинической лабораторной практике широко используются иммунохимические методы для определения традиционных биохимических объектов-белков, ферментов, гормонов, медиаторов, фармакологических препаратов и др. Достоинством их является высокая чувствительность и специфичность. Внедрение иммунохимических методов - один из способов дальнейшего совершенствования диагностики заболеваний сельскохозяйственных животных, так как многие серологические и аллергические методы, используемые в настоящее время для диагностики ряда важнейших заболеваний (туберкулез, бруцеллез, колибактериоз, сальмонеллез и др.), не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Основой успеха в иммунохимических исследованиях является получение иммунных сывороток высокого титра и нужной специфичности. Методы получения иммунных сывороток до настоящего времени остаются в основном эмпирическими. Различия в иммунологической реактивности у разных животных могут зависеть от возраста, пола, живой массы, состояния нервной и эндокринной систем, полноценности рациона, условий содержания и ухода, а также ряда других факторов, иногда очень трудно поддающихся учету и стандартизации. Поэтому иммунные сыворотки, полученные даже от животных одного вида и при одинаковой схеме иммунизации, могут резко отличаться как по титру, так и по набору антител.
При получении иммунных сывороток необходимо учитывать следующие основные условия.
Приготовление антигена. Он должен быть максимально очищен от примесей, что предотвращает появление антител с иной специфичностью. В тоже время очень важно учитывать лабильность антигенов, невысокую устойчивость к действию различных факторов и возможность их денатурации в процессе очистки.
Наиболее подходящая схема иммунизации для каждого конкретного случая выбирается эмпирически. Для стимуляции антителообразования используют различные адъюванты. Лучше брать небольшие дозы антигена, так как в этом случае сокращается расход ценных препаратов и уменьшается вероятность образования побочных антител.
3. Оценка полученной сыворотки обязательна, так как предсказать заранее ее качество невозможно. Проверке обычно подлежит титр антисыворотки, ее специфичность и авидность антител. Иммунная сыворотка должна быть по возможности более высокого титра и специфична, т. е. давать реакцию только с теми антигенами, которые подвергаются исследованию. Высокая авидность указывает на выраженное родство антигена и антитела.
Абсорбция и фракционирование иммунных сывороток. При фракционировании используют электрофоретические, хроматографические методы, выделение с помощью неорганических и органических (спирт, ацетон) осадителей, изоэлектрофокусирование и любой другой препаративный метод, позволяющий произвести очистку иммунной сыворотки и выделение антител нужной специфичности.
При проведении клинико-биохимических исследований наиболее широко используются реакция иммунодиффузии в геле (РИД), иммуноэлектрофорез, радиоиммунологический анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА) и некоторые другие.
Реакция иммунодиффузии в геле (РИД) используется для анализа многокомпонентных белковых систем, сравнительного анализа антигенной структуры белков и других антигенов. В основе этого метода лежит способность антигенов и антител диффундировать с различной скоростью, в результате чего эквивалентные соотношения определенных антигенов и антител достигаются в различных частях геля, где образуются соответствующие им линии преципитации.
По этому методу анализ проводится в плоской пластине агара, что позволяет разместить несколько различных антигенов вокруг резервуара с иммунной сывороткой и тем самым провести их сравнительный анализ. Основные положения, которые необходимо учесть при постановке двойной диффузии в геле, следующие:
Образование преципитата происходит в довольно узкой зоне эквивалентности, соответствующей такой концентрации антигена и антител, при которой оба компонента полностью включаются в преципитат.
Один антиген дает только одну зону преципитации.
Если в растворе присутствуют не один, а несколько антигенов, они ведут себя независимо друг от друга. Образуется столько линий преципитации, сколько имеется пар антиген-антитело.
Количество образующихся зон преципитации соответствует минимуму присутствующих в системе комплексов антиген-антитело.
Антигены и антитела, имеющие примерно равный коэффициент диффузии, образуют прямую полосу преципитации.
Если оба компонента используются примерно в эквивалентных количествах, то полоса преципитации располагается на равном удалении от резервуара с антигеном и антителом.
Если концентрация антигенов выше концентрации антител, то полоса преципитации располагается ближе к резервуару, содержащему антитела и наоборот. При значительном избытке одного из компонентов линия преципитации может быть «загнана» или в резервуар с антигеном, или в резервуар с антисывороткой и вообще не наблюдаться.
Если линию преципитации образует антиген с низкой молекулярной массой, то полоса преципитации при прочих равных условиях располагается ближе к резервуару с иммунной сывороткой.
Возможны три основных варианта результата двойной диффузии в геле: слияние линий преципитации (реакция идентичности), перекрещивание линий преципитации (реакция неидентичности), совмещение первого и второго случаев (реакция частичной идентичности - «шпора» или «двойная шпора»).
Радиоиммунологический анализ (РИА). Впервые этот метод был разработан для количественного определения инсулина с использованием гормона, меченого радиоактивным изотопом иода. В основе метода лежала конкуренция между нативным инсулином плазмы и меченым 131I - инсулином за ограниченное число специфических мест связывания на антителах к инсулину.
Для того, чтобы использовать метод радиоиммунологического анализа, необходимы: очищенный определяемый антиген, меченый антиген, связывающий агент, которым является моноспецифическая антисыворотка, метод разделения свободного и связанного лиганда.
Связывание радиоактивного меченого антигена с ограниченным количеством антител можно уменьшить добавлением немеченого антигена (определяемого вещества). По уменьшению связанного радиактив- ного антигена судят о количестве определяемого вещества.
Связанный в иммунных комплексах меченый антиген отделяют с помощью различных методов. В этих целях используют электрофорез и хроматографию, адсорбцию с помощью талька, активированного угля и других адсорбентов, фракционирование различными органическими и неорганическими реагентами, осаждение иммунных комплексов с помощью антиглобулиновой сыворотки (двойная система антител) и др. После удаления несвязанного антигена количество связанной метки определяют радиометрически.
Помимо классического РИА его можно приводить в твердофазном варианте. Принцип метода заключается в том, что твердую поверхность (чаще пластиковый планшет) нагружают антителами, а затем добавляют исследуемый раствор, содержащий определяемый антиген. К образующемуся на носителе комплексу антиген-антитело, после отмывания несвязавшегося антигена, добавляют избыток радиоактивно меченых антител. Количество связавшейся радиоактивной метки будет зависеть от количества антигена фиксированного на твердом носителе.
Твердофазный радиоиммунологический анализ можно проводить адсорбируя на пластиковой панели антиген, который связывает исследуемые антитела (например Ig G, содержащиеся в сыворотке крови овец). После отмывания остальных белков определяют количество связавшихся антител добавляя меченые 125I антитела кролика к Ig G овцы, а затем удаляя избыток меченого реагента. Количество радиактивной метки связанной в лунках пластиковой панели пропорционально количеству определенных антител.
С помощью радиоиммунологического анализа уже сейчас возможно определение более 300 биологически активных соединений, но наиболее широко он используется в эндокринологии.
Радиоиммунологический метод можно использовать и для определения низкомолекулярных соединений. В этом случае коньюгируют определяемые вещества с белками или другими высокомолекулярными соединениями для придания им антигенности. Именно таким путем разработаны радиоиммунологические методы определения простагландинов.
В настоящее время радиоиммунологический анализ проводят с помощью стандартных диагностических наборов, в которые входят все необходимое (реагенты, посуда, инструкция по применению), выпускаемые заводским способом. При наличии таких наборов радиоиммунологическое определение биологических объектов сводится к последовательному выполнению определенных операций и замеру радиоактивности.
Иммуноферментный анализ (ИФА). В начале семидесятых годов (1971-1972 г.г.) был разработан метод иммуноферментного анализа, в основе которого также как и метода РИА лежал закон действия масс, но вместо радиоактивной метки была использована ферментативная. Метод иммуноферментного анализа имел ряд преимуществ перед методом радиоиммунологического анализа.
1. В нем не использовались радиоактивные изотопы. Отсутствие радиационной опасности значительно упрощало условия проведения (специальные помещения, оборудование и т. д.).
Гораздо большая устойчивость меченых соединений (в РИА она определяется периодом полураспада изотопов).
Возможность быстрого определения результатов ферментативной реакции с помощью обычных общедоступных приборов (фотометров). Возможность даже визуальной оценки реакции.
ИФА легко поддается автоматизации.
Так же как и в РИА специфичность и чувствительность ИФА в сильной степени зависят от качества иммунной сыворотки. Необходимо использовать только высокоавидные и высокоспецифические антитела.
Широкое распространение метод ИФА получил при определении антител против бактериальных и вирусных антигенов таких как 0-антиген сальмонелл, 0-антиген и экзотоксин холерного вибриона, 0- антигенов бруцелл, М-белка стрептококков, антигенов микоплазм, рикетсий. Метод успешно применяется для обнаружения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, вируса болезни Ньюкасла, диагностики бруцеллеза, трихинеллеза, чумы свиней и др.
Метод ИФА можно широко использовать для обнаружения специфических антигенов возбудителей тех же заболеваний, а также самых различных химических соединений, которые могут выступать в качестве антигенов или гаптенов-антибиотиков, гормональных препаратов, микотоксинов, пестицидов и др.
Методы ИФА могут быть разделены на гетерогенные (твердофазные, ELISA) и гомогенные (БМТТ) отличающиеся по принципу проведения анализа. Гетерогенные методы ИФА основаны на использовании антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях (как правило пластик). Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения комплекса (меченое ферментом соединение - связывающий агент) от свободного меченого соединения. Гомогенные методы основаны на эффекте модуляции антителами активности фермента (или кофактора) используемого в качестве метки антигена.
В настоящее время разработано много вариантов ИФА-анализа. Выбор схемы анализа зависит от многих факторов, основными из которых являются молекулярная масса и валентность антигена, необходимый предел чувствительности, состав среды в которой необходимо определить антиген, свойства фермента, возможность получения антигенов и антител в чистом виде и многое другое.
Методы твердофазного (гетерогенного) ИФА, применение которых сопряжено с необходимостью разделения связавшихся антигенов разработаны для целого ряда разнообразных антигенов и антител. Среди этих методов можно выделить 2 типа: это методы последовательного (или неконкурентного) анализа и конкурентного анализа.
Метод неконкурентного анализа связан с осуществлением двухстадийного процесса. На первой стадии антитела адсорбированные на нерастворимом носителе или ковалентно связанные с ним взаимодействуют с антигеном. Несвязавшиеся компоненты отмывают и затем добавляют раствор, содержащий антитела, конъюгированные с ферментом. Вторая стадия процесса также завершается отмывкой несвязавшихся компонентов реакционной смеси после чего в систему вводят соответствующий субстрат для осуществления индикаторной ферментативной реакции.
При конкурентном гетерогенном анализе присутствующие в реакционной среде одновременно связанные и несвязанные с ферментативной меткой антигены (гаптены) вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизованными на твердом носителе антителами. После инкубации избыток не связавшихся компонентов отмывают и в систему добавляют соответствующий субстрат.
Вариант конкурентного анализа может использоваться как для определения антигенов, так и определения антител.
Принцип метода при определении антигенов заключается в том, что к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и синтезированный конъюгат антигена с ферментом. Определяемый и меченый антигены конкурируют за центры связывания антител. После определенного времени инкубации происходит перераспределение ферментного конъюгата между раствором и носителем. Измеряемая в растворе или на твердой фазе после промывки, концентрация метки пропорциональна (количественно связана) с начальной концентрацией определяемого антигена и после предварительной калибровки системы служит характеристикой его содержания в анализируемом образце.
Первым этапом будет присоединение антител к носителю. Антитела полученные к тому или иному химическому соединению (антигену) адсорбируются на твердую поверхность планшета. А затем избыток антител удаляют отмыванием.
Вторым этапом является внесение в лунки планшета с адсорбировавшими антителами определяемого соединения (антигена) и раствора конъюгата, представляющего собой молекулы антигена, химически меченые молекулами фермента. В течение некоторого периода инкубации происходит адсорбция как меченых, так и немеченых антигенов. Поэтому после отмывки буферным раствором на поверхности носителя останутся как меченые, так немеченые (определяемые) антигены, соотношение которых зависит от исходной концентрации антигенов определяемого раствора.
Третьим этапом является добавление субстрата, т. е. вещества на который действует фермент. Фермент адсорбированный из раствора конъюгата вместе с меченым антигеном катализирует химическую реакцию превращения субстрата в окрашенное соединение.
Четвертым этапом является добавление в лунки планшета фиксирующего реагента прекращающего ферментативную реакцию.
Измерение оптической плотности содержимого каждой лунки проводится с помощью специального фотометра или визуально.
Одновременно с анализируемым раствором в некоторые лунки одного и того же планшета вносятся стандартные растворы, после измерения оптической плотности которых строится калибровочный график, по которому легко вычисляют концентрацию контролируемого соединения в анализируемой пробе.
Метод в таком варианте может быть широко использован не только для целей серологической диагностики заболеваний, путем обнаружения соответствующих антигенов бактерий и вирусов, но и, например, для экспресс-контроля продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание опасных химических соединений, гормональных препаратов, антибиотиков, микотоксинов, пестицидов, в общем любых веществ, которые могут сыграть роль соответствующих антигенов (гаптенов) к которым могут быть получены антитела.
Необходимо учитывать только, что разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов, препятствует созданию универсальных методик получения антиген-ферментных комплексов. По существу, синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой отдельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена.
Метод конкурентного анализа для определения антигенов можно использовать в другом варианте с использованием меченых ферментами антител. Этот вариант имеет то преимущество, что для конъюгирования антител с разными ферментами существует ряд стандартных методик, позволяющих получить стабильные и активные препараты. Для целей ИФА могут быть использованы меченые глобулиновые фракции или IgG-фракция или аффинно выделенные чистые антитела.
В этом варианте первым этапом является присоединение антигена к носителю (т.е. уже антигены адсорбируются на твердую поверхность планшета) и избыток антигена отмывается буферным раствором. Вторым этапом является внесение в лунки планшета с адсорбированным антигеном меченых ферментами антител и стандартного или исследуемого раствора антигена. Связывание меченых антител конкурентно тормозится определяемым антигеном. При этом количество связанных меченых антител обратно пропорционально концентрации определяемого антигена. Третьим этапом, как и в предыдущем методе, является добавление субстрата, четвертым - фиксирующего вещества, прекращающего ферментативную реакцию и пятым - измерение оптической плотности.
К числу неконкурентных методов анализа относится метод двойных антител или (сэндвич-метод). Данный метод является широко распространенным для определения антигенов обладающих более, чем одной антигенной детерминантой.
Принцип этого варианта метода заключается в том, что на носителе (планшет) фиксируют антитела, затем наносят раствор, содержащий исследуемый антиген, образуется фиксированный на носителе комплекс антиген-антитело, к которому добавляют меченые ферментом антитела. В процессе анализа антиген как бы «зажат» между молекулами антител, что и обусловило название метода - «сэндвич».
Анализаторы, предназначенные для определения сходных по химической природе компонентов. Например, автоматический анализатор аминокислот или автоматический атомно-абсорбционный спектрофотометр.
Многоцелевые биохимические анализаторы, предназначенные для определения большого числа компонентов, различающихся по своей химической природе.
В основе работы автоматических анализаторов положены 2 принципа - поточной и дискретный. В анализаторах поточного типа химические реакции проводятся в потоке транспортируемых по трубкам и разделенных воздушными прослойками проб. Вариантом этого способа является проточно-инжекционный анализ, заключающийся в введении (инжекции) определенного образца в непрерывной поток носителя. При малом объеме анализируемой жидкости, большой скорости движения носителя в капиллярной трубке, отдельные пробы не смешиваются друг с другом, а лишь в небольшой степени разбавляются жидкостью- носителем.
В автоанализаторах, основанных на дискретном принципе работы, в специальную реакционную емкость из пробоотборника вносятся анализируемая проба и химические реагенты. После прохождения химической реакции проводится детектирование ее результатов. Дискретная технология наиболее широко используется в автоанализаторах, предназначенных для клинико-биохимических исследований.
Использование автоматических анализаторов имеет ряд важных преимуществ по сравнению с обычной ручной (мануальной) работой, выполняемой непосредственно лабораторными работниками. Это, во- первых, высокая производительность (до 800 и более исследований в час), использование небольших объемов биологической жидкости (3-7 мкл), экономное расходование реактивов (в 5-10 раз меньше). Применение автоматизированных устройств позволяет использовать различные режимы определения, современную компьютерную технику, возможность выполнения экстренных исследований, обеспечивает высокую надежность определения, связанную с использованием новейших технологий.
Биохимические автоанализаторы характеризуются определенными технико-аналитическими данными (производительностью, последовательностью проведения анализа, системой детектирования светового сигнала и др.), которые необходимо учитывать при выборе прибора, сопоставляя их с целями исследования. При оценке анализаторов следует учитывать также особенности компьютерного обеспечения.

ЗаключениеБиохимические методы исследования (в диагностике) – методы исследования химических компонентов биологических жидкостей, клеток и тканей, а также процессов превращения веществ и энергии, протекающих в организме человека в норме и патологии. Для целей клинической диагностики представляет интерес: химический состав биологических жидкостей и тканей организма (патология может проявляться изменением концентрации, или отсутствием одного из обычных компонентов, или появлением необычного компонента), распределение жидкости и химических компонентов между различными «структурами» организма и отдельной клетки, процессы превращения химических компонентов в целом организме или различных его органах и их регуляция с помощью медиаторов, гормонов, тканевых гормонов, ферментов; процессы обмена организма с внешней средой. Исследованию подвергаются входящие в состав живых организмов неорганические, органические вещества и макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Исследование может проводиться in vitro в пробах биологических жидкостей (кровь, моча, цереброспинальная жидкость, нот, пищеварительные соки и т. д.), патологических жидкостей (отечной, асцитической, плевральной, перикардиальной, внутрисуставной и т. д.) или ткани, а также выдыхаемого воздуха, in vivo с помощью введенных в организм датчиков (ионоселективных электродов).
В диагностической практике наибольшее распространение получили Биохимические методы исследования отдельных химических компонентов, их соединений и соотношений между ними в пробах биол, жидкостей (кровь, моча и т. д.). В зависимости от характера исследования Биохимические методы исследования могут быть разделены на качественные (обнаружение искомого вещества в пробе биол, жидкости или ткани) и количественные (определение или измерение его содержания). Качественные методы (см. Аналитическая химия) большей частью основаны на использовании характерного для исследуемого вещества свойства, проявляющегося при определенном хим.-физ. воздействии (прибавление соответствующего реагента, нагревание и т. п.). Этот же принцип лежит в основе прямых количественных методов исследования. Однако поскольку состав биол, жидкостей довольно сложен, при количественном определении хим. компонента обычно в качестве первого этапа исследования выделяют из биол, жидкости искомое вещество (или группу близких веществ), а затем идентифицируют его (по тому или иному характерному свойству) и измеряют содержание (концентрацию). В ряде случаев разделение веществ, идентификация и измерение концентрации могут быть проведены одномоментно, напр, при исследовании биол, жидкости методом газовой хроматографии
Список литературы
1. Биология с общей генетикой. Слюсарев А.А. изд. 2-Е, М.: Медицина, 2007.
2. Гилберт С. Биология развития: в 3 т. / Пер. с англ. - М.: Мир, 2008.
3. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология: в 3 т. / Пер. с англ. - М. : Мир, 2009.
4. Пехов А.П. Биология. Медицинская биология, генетика и паразитология. Учебник. Изд.2-е, испр. и доп.- М.: РУДН, 2007. – 664 с.