Доклад по молекулярной биологии

Общая характеристика репликации ДНК: основные принципы,
особенности механизма.
Репликация ДНК – это молекулярный процесс точного копирования
молекул ДНК (ее нуклеотидной последовательности). С помощью механизма
репликации происходит точная передача генетической информации от клетки к
клетке и, таким образом, все клетки многоклеточного организма являются
носителями одной и той же наследственной информации. Процесс синтеза ДНК
сопровождается множеством событий и является, как правило, точным. Из
одной молекулы ДНК синтезируются две идентичные дочерние молекулы. Этот
процесс становится возможным благодаря структурным особенностям
молекулы ДНК:
 двухцепочечная структура;
 комплементарность и антипараллельность.
Основными характеристиками репликации являются:
 синтез ДНК является полуконсервативным, так как каждая цепь
служит матрицей для синтеза дочерней цепи;
 репликация носит двунаправленный характер;
 синтез новой цепи осуществляется только в направлении 5'→3';
 в репликации участвует значительное количество белковых
факторов.
Аппарат репликации включает ДНК–матрицу с точкой инициации,
нуклеозидтрифосфаты и белки, участвующие в деспирализации
двухцепочечной молекулы ДНК, в инициации репликации, в полимеризации
нуклеотидов и др.
Точка начала репликации представлена специфичной
последовательностью нуклеотидов, которая называется автономной
последовательностью репликации, точкой ori. Участок ДНК который содержит
точку ori который способен к независимой репликации называется репликон. У

прокариот каждая молекула ДНК представляет один репликон, у эукариот ДНК
содержит больше точек начала (οri), и соответственно больше репликонов.
Точка инициации ori имеет следующую структуру:

ОRЕ – сайт ДНК, который соединяется с сайтспецифическими белками и
белками репликации;
DUЕ – участок ДНК, который легко деспирализуется, чувствителен к
нуклеазам и не чувствителен к мутациям;
А/Т – последовательность, регулирующая активность геликаз;
АUX-2 и АUX-1 – последовательности, которые соединяются с
высокоспецифичными факторами инициации репликации.
У прокариот точка инициации фиксирована на плазматической мембране,
а у эукариот она фиксируется с помощью металлопротеидов к белковой оси
хромосом (SAR).

Ферменты аппарата репликации

В репликации ДНК участвует большое количество белковых факторов и
ферментов.
ДНК-геликазы осуществляют деспирализацию и денатурацию участка
ДНК с использованием энергии гидролиза АТФ и образование репликационной
вилки. В связи с наличием двух репликационных вилок, существуют две
геликазы, которые передвигаются в разных направлениях от точки инициации
репликации.
Праймаза – фермент, который инициирует синтез ДНК за счет синтеза
небольшого фрагмента, состоящего из 11-12 рибонуклеотидов, - праймера или
затравки (РНКпраймер). Геликаза совместно с праймазой образует комплекс -
праймосома.
Топоизомераза I разрывает только одну из двух цепей двойной спирали
ДНК, расщепляя фосфодиэфирные связи, что предупреждает
суперспирализацию молекулы ДНК.
Топоизомераза II ковалентно связывается с обеими цепями двойной
спирали ДНК и вносит в нее на время двухцепочечный разрыв.

Стабилизация одноцепочечной молекулы ДНК в процессе репликации
Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК (SSB – белки), это
факторы, стабилизирующие одноцепочечную ДНК в области денатурации и
препятствующие комплементарному спариванию двух цепей или различных
участков одной и той же цепи, имеющих палиндромные последовательности.

ДНК-полимеразы - ферменты, способные синтезировать новые цепи ДНК
с матричной цепи. Было обнаружено три класса полимераз у прокариот (I, II,
III) и полимеразы α, β, γ, δ, ε у эукариот.
ДНК-лигаза – это фермент, связывающий участки вновь синтезированной
ДНК, посредством образования фосфодиэфирных связей 3'→5'.
Механизм репликации. Синтез начинается с момента деспирализации
цепей ДНК и образования репликационной вилки. Каждая цепь представляет
матрицу для вновь синтезируемой цепи. Деспирализация двух цепей ДНК
необходима для того, чтобы каждое основание обеих цепей оказалось
доступным для узнавания новыми основаниями и комплементарного
спаривания. Синтез осуществляется в двух направлениях; от каждой точки
инициации образуются две репликационные вилки в противоположном
направлении.
Для инициации репликации необходим белковый комплекс, названный
реплисомой, который узнает точку инициации и запускает механизм
репликации. Белок / белки, распознающие точку инициации (у дрожжей
известно 5 белков), связываются с ori и инициируют деспирализацию ДНК в
сайте DUE.
Реплисома движется вдоль ДНК и осуществляет синтез обеих цепей
репликационной вилки. Репликация представляет собой непрерывный рост
обеих цепей спирали ДНК. Необходимо подчеркнуть что:
 считывание информации с матрицы осуществляется только в
направлении 3'→5';
 синтез новой цепи осуществляется только в направлении 5'→3'.
Репликационная вилка асимметрична. Из двух синтезированных
дочерних цепей ДНК:
 одна цепь синтезируется непрерывно в направлении
 5'→3' и называется ведущей (лидирующей) цепью. Она считывается
в направлении 3'→5' с матричной цепи 3'→5';
 другая цепь синтезируется с матричной цепи 5'→3'.

Считывание происходит также в направлении 3'→5', а новую цепь
называют отстающей цепью. Она синтезируется прерывисто, с образованием
фрагментов Оказаки. Длина фрагментов Оказаки у прокариот составляет -
1000-2000, а у эукариот – 100-200 нуклеотидов.
31) Общие факторы транскрипции у эукариот.
Общие факторы транскрипции (англ. general transcription factors, GTFs,
basal transcriptional factors) — класс белковых транскрипционных факторов,
которые помогают правильно располагать РНК-полимеразу
II эукариот на промоторе, а также содействуют разделению двух цепей ДНК,
чтобы обеспечить возможность начала транскрипции в этом месте, и
способствуют освобождению РНК-полимеразы от промотора при переходе от
инициации транскрипции к элонгации транскрипции. Название «общие»
связано с тем, что они требуются для работы почти всех промоторов,
используемых РНК-полимеразой II. Кроме того, GTFs взаимодействуют
с медиатором — одним из ключевых элементов транскрипционного аппарата,
необходимым для правильного взаимодействия с РНК-полимеразой II
активаторных белков и GTFs. Общие транскрипционные факторы
обозначаются TFII (от англ. — фактор транскрипции РНК полимеразы II). К
числу GTFs относят TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIG, TFIIH.
GTFs эукариот выполняют функции, аналогичные функциям σ-
фактора бактерий, кроме того, части TFIIH имеют ту же трёхмерную структуру,
что и аналогичные части σ-фактора.
Сборка комплекса инициации транскрипции

Комплекс инициации транскрипции
Общие факторы собираются на промоторе РНК-полимеразы II
в преинициаторный комплекс (комплекс инициации
транскрипции, англ. transcription initiation complex) следующим образом.

Промотор РНК-полимеразы II обычно имеет особую последовательность,
называемую ТАТА-боксом, которая находится на расстоянии
25 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции. Фактор TFIID распознаёт и
связывает ТАТА-бокс через свою субъединицу TBP, после чего рядом с ним с
ДНК связывается TFIIB. TFIID сильно искажает трёхмерную структуру ДНК в
области ТАТА-бокса, и это искажение, вероятно, служит механическим
ориентиром для определения положения активного промотора. После этого к
промотору присоединяются остальные общие факторы транскрипции и сама
РНК-полимераза II, образуя полноценный комплекс инициации транскрипции.
Далее TFIIH с использованием АТФ разъединяет две цепи ДНК в точке начала
транскрипции, попутно выставляя наружу матричную цепь. Он также содержит
субъединицу с протеинкиназной активностью, которая фосфорилирует РНК-
полимеразу II, в результате чего её конформация меняется так, что она
освобождается от GTFs и приступает к элонгации. Фосфорилирование РНК-
полимеразы II осуществляется по С-концевому домену, состоящему из
52 тандемных 7-аминокислотных повторов; фосфорилируется 5-й
остаток серина в каждом повторе. После отделения РНК-полимеразы II от ДНК
факторы транскрипции также отделяются от ДНК.
Приведённая выше последовательность связывания наблюдается в
условиях in vitro; in vivo порядок сборки общих факторов транскрипции на
промоторе может изменяться от гена к гену.
Название Количество

субъединиц Функции

TFIID
TBP-субъединица
TAF-субъединицы

1~11

Распознаёт ТАТА-бокс
Распознают другие последовательности
ДНК вокруг сайта начала транскрипции,
регулируют связывание ДНК припомощи
TBP

TFIIA 2

Взаимодействует с субъединицей TBP
TFIID и участвует в связывании TBP с
ТАТА-боксом

TFIIB 1

Распознаёт элемент BRE в промоторах,
точно ориентирует РНК-полимеразу II в
точке начала транскрипции

TFIIF 3

Стабилизирует взаимодействие РНК-
полимеразы с TBP и TFIIB, способствует
связыванию с TFIIE и TFIIH
TFIIE 2 Рекрутирует и регулирует TFIIH

TFIIH 9

Расплетает ДНК в сайте начала
транскрипции, фосфорилирует РНК-
полимеразу II и высвобождает её с
промотора

37) Механизм транскрипции: инициация, элонгация и терминация.
Транскрипция — это процесс синтеза молекулы РНК на участке ДНК,
используемом в качестве матрицы. Смысл транскрипции заключается в
переносе генетической информации с ДНК на РНК.
Молекула ДНК состоит из двух комплиментарных друг другу цепей, а
РНК — только из одной. При транскрипции матрицей для синтеза РНК служит
только одна из цепей ДНК. Ее называют смысловой цепью. Исключением
является митохондриальная ДНК, в которой обе цепи являются смысловыми и
содержат разные гены. Также как исключение на ядерной ДНК некоторые гены
могут быть локализованы на несмысловой цепи.
При транскрипции молекула РНК синтезируется в направлении от 5' к 3'
концу (что естественно для синтеза всех нуклеиновых кислот), при этом по
цепи ДНК синтез идет в обратном направлении: 3'→5'.
У эукариот каждый ген транскрибируется отдельно. Исключение опять
же представляет митохондриальная ДНК, которая транскибируется на общий
мультигенный транскрипт, который затем разрезается. Так как у прокариот
гены образуют группы, формируя один оперон, то такие гены
транскрибируются вместе. В любом случае транскриптоном называют участок
ДНК, состоящий из промотора, транскрибируемого участка и терминатора.
Механизм транскрипции.
Транскрипция создает одноцепочечную молекулу РНК из
двухцепочечной ДНК. Поэтому только информация в одной из цепей
передается в нуклеотид последовательность РНК. Одна нить ДНК называется
кодирующей нитью, а другая – матричной нитью. Механизм транскрипции
взаимодействует с шаблоном, чтобы произвести мРНК чья последовательность

напоминает кодирующую цепь. Другие названия для шаблонной цепи
включают антисмысловую цепь и главную цепь.
Два разных гена на одной молекуле ДНК могут иметь кодирующие
последовательности на разных цепях.
Транскрипционная активность особенно высока в фазах G1 и G2
клеточный цикл когда клетка либо восстанавливается после митоз или
готовится к драматическим событиям следующего цикла деление клеток.
В транскрипции выделяют 3 стадии: инициация, элонгация, терминация.
Инициация транскрипции позволяет начаться синтезу молекулы РНК.
Инициация включает присоединение к промотору комплекса ферментов.
Главным из них является РНК-полимераза (в данном случае ДНК-зависимая),
которая, в свою очередь, состоит из нескольких белков-субъединиц и играет
роль катализатора процесса. У эукариот на инициацию транскрипции влияют
особые участки ДНК: энхансеры (усиливают) и сайленсеры (подвляют),
которые обычно удаленные на некоторое расстояние от самого гена.
Существуют различные белковые факторы, влияющие на возможность
инициации транскрипции.
У прокариот имеется только один тип РНК-полимеразы, в то время как у
эукариот их три. РНК-полимераза-1 используется для синтеза трех видов
рибосомальной РНК (всего существует 4 вида рРНК). РНК-полимераза-2
используется для синтеза пре-иРНК (предшественника информационной) РНК.
РНК-полимераза-3 синтезирует один из видов рибосомальной РНК,
транспортную и малую ядерную.
РНК-полимераза способна распознавать определенные
последовательности нуклеотидов и прикрепляется к ним. Эти
последовательности короткие и универсальные для всего живого.
После того, как РНК-полимераза присоединяется к промотору, участок
двойной спирали ДНК раскручивается и между цепочками этого участка
разрываются нуклеотидные связи. Расплетается примерно 18 пар нуклеотидов.

На стадии элонгации происходит последовательное присоединение по
принципу комплиментарности свободных нуклеотидов к освобожденному
участку ДНК. РНК-полимераза соединяет нуклеотиды в
полирибонуклеотидную цепочку.
При синтезе РНК около 12 ее нуклеотидов комплементарно временно
связаны с нуклеотидами ДНК. При движении РНК-полимеразы впереди нее
цепочки ДНК расходятся, а сзади «сшиваются» с помощью ферментов. Цепь
РНК постепенно растет и выдвигается из комплекса РНК-полимеразы.
Существуют элонгирующие факторы, препятствующие преждевременной
остановки транскрипции.
Терминация процесса транскрипции происходит в участке-терминаторе,
который распознается РНК-полимеразой благодаря специальным белковым
факторам терминации.
К 3'-концу синтезированной молекулы РНК присоединяется множество
адениновых нуклеотидов (поли-А) для предотвращения ее ферментативного
распада. Еще ранее, когда был синтезирован 5'-конец, на нем был образован так
называемый кэп.
В большинстве случаев в результате транскрипции не получается готовая
РНК. «Сырая» РНК должна еще пройти процесс процессинга, при котором
происходят ее модификационные изменения и она становится функционально
активной. Каждый тип РНК эукариот подвергается своим модификациям.
Формирование поли-А и кэпа часто также относят к процессингу.