Иммунодефицит кошек в многопрофильном центре доктора Котова

ВведениеАктуальность темы исследования.Иммунодефицит кошек - серьезное заболевание, вызываемое вирусом иммунодефицита кошек (FIV), поражающим иммунную и нервную системы. Заболевание характеризуется медленным, постепенным развитием, полиморфизмом клинических проявлений и высокой летальностью.Вирус был впервые выделен в 1987 году от группы кошек, содержавшихся в питомнике в городе Паталума на севере Калифорнии. Затем вирус был обнаружен в Швейцарии и других странах Европы (Великобритания, Франция, Голландия). На сегодняшний день инфекция стала эндемической для кошек по всему миру.Вирус принадлежит к семейству Retroviridae из рода лентивирусов. В эту таксономию также включен вирус иммунодефицита человека, что объясняется наличием общих признаков с их характерной видовой специфичностью. Особенностью семейства Retroviridae является характерная морфология, наличие обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-полимераза) в вирионе и антигенная структура. Вирионы ретровирусов представляют собой частицы сферической формы диаметром 80-100 нм. Вирусы отличаются лабильностью. При комнатной температуре они сохраняются до 4 дней. Кипячение их быстро убивает, а при нагревании до 60 градусов смерть наступает в течение 30 минут. Обработка спиртом, эфиром, гипохлоритом приводит к инактивации вируса в течение 5-10 минут. Вирусы относительно устойчивы к ультрафиолетовому излучению.Степень разработанности темы.Изучению вирусного иммунодефицита у кошек посвящены многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей. Однако, несмотря на многолетний опыт и многочисленные попытки, до сих пор не удалось создать эффективную вакцину, защищающую кошек от инфекции вирусного иммунодефицита. Лечение этого заболевания у животных не получило широкого распространения из-за низкой эффективности и ограниченной доступности. Наиболее распространенные диагностические тесты имеют ряд ограничений. Таким образом, эффективность серологической диагностики снижается из-за иммунотропности вируса и склонности заражения к длительному латентному периоду. Другие методы (вирусологические, ПЦР в реальном времени) недоступны из-за сложности реализации или необходимости специального оборудования.Тем не менее, высокая распространенность вирусного иммунодефицита у кошек из-за низкой эффективности существующих мер профилактики, учитывая тенденцию к комбинированному течению ретровирусных инфекций у кошек, указывает на необходимость изучения этих заболеваний и совершенствования методов их диагностики.Цель работы: Исследование иммунодефицита кошек в многопрофильном центре доктора Котова.Задачи работы: - Описание вирусного иммунодефицита кошек: состояние изученности вопроса в историческом аспекте и эпизоотическая ситуация- Изучение характеристики возбудителя иммунодефицита кошек и его генетических детерминант, патогенез инфекции- Изучение вирусологических методов исследования- Изучение микроскопических методов исследования- Описание серологической диагностики ретровирусных инфекций кошек- Описание полимеразной цепной реакции в диагностике ретровирусных инфекций кошек: преимущества, недостатки, модификации методаГлава 1. Общее понятие иммунодефицита кошек1.1 Вирусный иммунодефицит кошек: состояние изученности вопроса в историческом аспекте и эпизоотическая ситуацияПервый случай выделения вируса иммунодефицита кошек (FIV) был зарегистрирован в 1986 году в детском саду в городе Паталума, Северная Калифорния, ветеринаром Педерсеном и его коллегами (Pedersen N.C. et al., 1987). Впоследствии вирус был обнаружен в Швейцарии и других странах Европы, таких как Великобритания, Франция и Нидерланды. Заболевание стало эндемическим для кошек по всему миру. Он сопровождается развитием множества клинических симптомов, которые влекут за собой нарушение правильного функционирования иммунной системы. При этом инфекции, вызванной вирусом лейкемии кошек, в колонии не выявлено. Секвенирование послужило основой для классификации вируса как принадлежащего к семейству Retroviridae и присвоения ему названия кошачьего Т-лимфотропного лентивируса.Профессор патобиологии Колледжа ветеринарной медицины Ямамото посвятил большую часть своей карьеры исследованиям и борьбе с этим заболеванием. В 1985 году она основала Лабораторию сравнительной иммунологии и ретровирологии в Университете Дэвиса. Вместе с Нильсом Педерсоном они работали над побочным продуктом FIV и опубликовали свои результаты в журнале Science еще в 1987 году.В 1991 г. FIV был отнесен к роду Lentivirus семейства Retroviridae, а в 2002 г. род Lentivirus был добавлен к подсемейству Orthoretrovirinae.В настоящее время в группе лентивирусов кошек различают 6 генотипов: A, B, C, D, E и F. Вирусное разнообразие FIV определяется геном env. Кроме того, в естественных популяциях было идентифицировано несколько межподтипов рекомбинантов FIV: A / B, A / C и B / D (Bachmann M.H. et al., 1997; Hayward J.J., Rodrigo A.G., 2008). Исследуемый вирус отличается, среди прочего, особым генетическим разнообразием: нуклеотидные последовательности могут изменяться до 15% внутри подтипов и до 38% между подтипами.Возбудитель вируса иммунодефицита кошек, вирус иммунодефицита кошек (FIV), включен в род лентивирусов. Лентивирусы не являются онкогенными и способны вызывать в организме медленные, хронические и дегенеративные патологические изменения в инфицированном организме; их часто связывают с развитием аутоиммунных поражений. Все лентивирусы в первую очередь инфицируют моноциты и макрофаги крови. FIV инфицирует Т-клетки и поэтому ассоциируется в первую очередь с клиническими признаками иммунодефицита инфицированного организма.Вирус лейкемии кошек (FeLV), тесно связанный с FIV, был впервые обнаружен у домашних животных доктором Джарнеттом в 1964 году в Университете Глазго в Шотландии. FeLV включает пять подгрупп в соответствии с антигенными различиями, определяемыми геномом. Различают типы вируса A, B, C, T и D. Возбудитель лейкоза кошек существует в двух формах - экзогенной (патогенной) и эндогенной (непатогенной).1.2 Характеристика возбудителя иммунодефицита кошек и его генетических детерминант, патогенез инфекцииВирион имеет структуру по типу симметрии икосаэдра. Диаметр 80-110 нм, сверху - гликолипидная оболочка. Нуклеоид и центральная часть содержат рибонуклеопротеин (60-70S РНК), который находится в капсиде белка. Матричный белок расположен между мембраной и капсидом. В FeLV нуклеоид находится в центре вириона, интересно, что ядро ​​капсулы очень прочно прилегает к нему. Нуклеоид FIV имеет форму так называемого стержня или усеченного конуса. В верхнем слое раковины имеются острые булавовидные шипы, которые состоят из гликопротеина, длина которого составляет около 8 нм. Пеплос, внешняя гликолипидная мембрана, как правило, возникает, когда вирусы отрываются от плазматической мембраны клетки-хозяина. Плотность вириона 1,15-1,19 г / см3, ядра 1,21-1,2 г / см3, нуклеотида 1,26-1,31 г / см3. Вирионы также содержат 1-2% РНК, 60% белков, 35% липидов, 3,5% углеводов в пересчете на сухое вещество. Липиды являются частью липопротеидной мембраны и имеют клеточное происхождение, углеводы входят в состав гликопротеинов. Они очень чувствительны к гидрофобным растворителям и повышенной температуре.Ферменты - один из важных компонентов вириона ретровируса. Ядро содержит более 10 ферментов, например, обратную транскриптазу, которая обладает тремя ферментативными активностями:- РНК-зависимая полимераза, которая стимулирует синтез одноцепочечной комплементарной ДНК (кДНК) на матрице РНК вириона;- ДНК-зависимая ДНК-полимераза, регулирующая синтез 2-й спирали ДНК;- рибонуклеаза (рибонуклеаза H), которая гидролизует РНК как часть гибрида РНК-ДНК. В своем капсиде ретровирус несет свою собственную ревертазу, в противном случае ферменты не смогли бы правильно функционировать во время репликации в инфицированной клетке из-за необычной природы вируса.Диплоидный вирусный белок состоит из двух идентичных одноцепочечных молекул положительной РНК (8-9,5 т.п.н.), нековалентно связанных друг с другом около 5'-концов. Образование гетерозиготных частиц при смешанной инфекции может быть механизмом создания генетического разнообразия путем рекомбинации. В своем составе ретровирусные частицы несут производные клеточной РНК от различных хозяев, которые, как правило, составляют около половины всей РНК вириона.Вирионы ретровируса кошек имеют три гена, подходящих для репликации: gag (группоспецифический антиген), который реплицирует основной белок; pol, кодирующая обратную транскриптазу (полимеразу), и env, кодирующую белки оболочки. Их расположение в геномах всех ретровирусов: gag-pol-env, по правилам, от 5 'до 3' конца РНК. Вирусный геном имеет донорский сайт сплайсинга, расположенный рядом с геном gag, и акцепторный сайт, расположенный в непосредственной близости от гена env. Продукт гена env синтезируется из субгеномной мРНК, которая возникает в результате объединения этих сайтов. Продукты генов gag и pol считываются с мРНК, которая напоминает полноразмерную РНК вириона. Каждая РНК полиаденилирована на 3'-конце и закрыта на 5'-конце. Cap, иначе известный как модифицированный рибонуклеотид, обеспечивает эффективный процессинг РНК, ядерный экспорт, трансляцию и защиту от быстрой деградации.Полиаденилирование влияет на время существования РНК, а также на уровень и избирательность синтеза.В вирионах ретровирусов идентифицировано 6-7 белков. Во внешней оболочке вирионов есть два белка - поверхностный и трансмембранный. Они содержат типоспецифические детерминанты AH, которые стимулируют синтез антител, направленных на уничтожение вируса. Ядро содержит 3-4 белка, один из которых имеет тесную связь с РНК. Коровые белки являются группоспецифичными антигенами.Ретровирусные белки называют по размеру, который определяется их электрофоретической активностью в геле, содержащем SDS, типом модификации (фосфорирование или гликозилирование) и геном, кодирующим их. Например, фосфопротеин с мол. массой 12 К, также кодируемый геном gag - pp12 gag, и гликопротеином с мол. массой 70 К, кодируется геном env - gp70gag. Процессинг полипротеинов-предшественников приводит к образованию белков вирионов.Как только вирус иммунодефицита кошек был обнаружен, его геном был изучен методами секвенирования и молекулярного клонирования. Помимо трех структурных генов: 5'-gag-pol-env-3 ', FIV содержит еще несколько регуляторных последовательностей:1) rev (регулятор экспрессии вирусных белков), содержащий два экзона; белок, который он кодирует, активирует синтез структурных белков патогенов, способствует экспорту длинных молекул вирусной РНК из ядра, на последних стадиях заражения угнетает синтез регуляторных белков;2) ген dUTPase, расположенный в рамке на территории pol гена, отвечает за исключение неправильного введения урацила в молекулу РНК вируса при его удвоении и, как следствие, его аттенуации;3) orf-A (Orf-2), кодирующий белок, имеет в своем составе 77 аминокислот. Очень похож на продукт экспрессии гена tat (трансактиватора) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ); он не обладает способностью к трансактивации, тогда как белок играет важную роль на первой стадии клеточной инфекции и в образовании вирусной частицы. Локализован в ядре. Этот процесс делает его более похожим по свойствам на ген vpr ВИЧ (вирусный белок K). Orf-A контролирует репликацию вируса, не позволяя клетке-хозяину погибнуть. Экспрессия вирусного генома стимулируется, а экспрессия определенных клеточных генов подавляется. Однако, если функция белка orf-A нарушена, способность вируса к репликации снижается и его патогенность снижается;4) vif (фактор инфекционности вириона) способствует кодированию белка, необходимого для образования полноценных вирусов в специальных клетках на последней стадии инфекции. Продукт экспрессии этого гена вводится в зрелые вирионы в достаточных количествах, что позволяет им быть сильно инфицированными.Геном FeLV содержит структурные геномные элементы gag-pol-env и не имеет дефектов репликации. У вируса отсутствует настоящий онкоген (onc), который образует больные опухолевые клетки.Патогенетические особенности ретровирусных инфекций кошекБольшинство ретровирусов поражают одну из основных частей иммунной системы, а именно лимфоциты. Вирус иммунодефицита превращает их в фабрики, воспроизводящие те же вирусные клетки, а вирус лейкемии превращает их в опухолевые клетки. Отрицательно страдает вся иммунная система. Фагоцитоз останавливается на тканевом уровне, организм перестает вырабатывать антитела для гуморальной защиты. Оказывается, вирусы убивают систему организма, которая предназначена для борьбы с инфекциями, для стимуляции гомеостаза в организме в целом.Размножение ретровирусов происходит в цитоплазме и ядре клетки, где существует выраженная стадия. Весь цикл репликации ретровируса можно разделить на несколько этапов:1.прикрепление вируса к клеточным рецепторам;2.слияние суперкапсида с клеточной оболочкой;3.освобождение вирусной РНК от белка;4.обратная транскрипция;5.импорт провируса в ядро;6.интеграция в клеточный геном;7.транскипция провируса;8.экспорт РНК из ядра;9.трансляция вирусных белков;10.сборка вирусной частицы;11.одевание вируса;12.выход вириона из клетки;13.созревание вирусной частицыВместе в комплексе липопротеиновая мембрана и плазматическая мембрана клетки позволяют ретровирусному вириону проникать в саму клетку, и проникновение также может происходить в результате эндоцитоза. Связывание вирионов с определенными клеточными рецепторами происходит благодаря поверхностным гликопротеинам (SU) вируса; на его стенке есть специфический сайт связывания соответствующих рецепторов. Взаимодействие рецептора с поверхностным гликопротеином вызывает конформационные изменения трансмембранного гликопротеина вируса, что приводит к слиянию вирионной мембраны с клеточной мембраной. Этот процесс приводит к высвобождению нуклеокапсида в цитоплазму клетки, после чего начинается процесс РНК-зависимой ДНК-полимеразы вириона. В цитоплазме клетки наблюдается синтез ДНК на матрице РНК вириона с использованием обратной транскриптазы. Провирусная ДНК направляется в ядро ​​как «преинтеграционный комплекс». Обязательным условием для проникновения провирусной ДНК является растворение клеточной мембраны, поэтому интеграция происходит на стадии митоза. В этом случае ретровирусы также могут проникать в ядра покоящихся клеток.Клетки, воспроизводящие вирус, состоят из 10 копий провируса. Первые экземпляры наблюдаются уже через восемь часов после заражения. Большая часть копий провирусной ДНК образуется не позднее, чем на третьи сутки после заражения. Клетка, подвергшаяся воздействию вируса, будет инфицирована до тех пор, пока не произойдет вмешательство из-за накопления вирусного гликопротеина.Следующим шагом после интеграции является экспрессия встроенного провируса. Если этот этап не начинается, инфекция скрытая. При делении инфицированной клетки провирус создает свои копии вместе с геном клетки, при этом он обнаруживается в каждой из дочерних клеток. Между тем экспрессия генома этого вируса стимулируется эпигенетическими регуляторами. Клеточные эпигенетические механизмы влияют на латентность провируса и его реактивацию, воздействуя на хромосому рядом с вирусным промотором, который расположен в последовательности LTR на 5'-конце.Несомненно, биология ретровирусов одинакова, хотя нельзя исключать различия между видами, так как это сильно влияет на патогенность ретровируса. Если мы сравним вирусы лейкемии и иммунодефицита кошек друг с другом, то первый будет признан более патогенным, чем второй. Считается, что около трети всех зарегистрированных случаев смерти кошек приходится на рак, вызванный FeLV. В этом случае вирус лейкемии также вызывает другие серьезные последствия, такие как анемия и вторичные инфекции, которые возникают, когда этот вирус отрицательно влияет на иммунную систему, а также на костный мозг.Вирусы FIV и FeLV развиваются в лимфоцитах крови, но патогенный механизм действия различен. Вирус лейкемии в основном поражает хелперные Т-лимфоциты, а вирус иммунодефицита поражает В-клетки.FIV развивается так же, как и ВИЧ-инфекция у человека, в несколько фаз: острая, клинически бессимптомная различной продолжительности и терминальные фазы. Поэтому инфицирование FIV часто называют «синдромом приобретенного иммунодефицита кошек» - СПИДом. Нет никакой разницы между этими шагами у кошек, инфицированных естественным ВИК. Кошки, несмотря на их очень тяжелое состояние, часто сопровождающееся тяжелой иммуносупрессией и вторичными инфекциями, надеются на частичное выздоровление при надлежащем уходе. Вероятно, что бессимптомная стадия вернется.FIV заражает кошку через инфицированные фагоцитарные клетки и лимфоциты CD4. Они действуют как Т-помощники, которые играют важную роль в функционировании иммунной системы и способны развивать как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Гликопротеин вируса gp120 взаимодействует с первичным рецептором, расположенным на поверхности клетки. Благодаря постоянной репликации в фагоцитарных клетках популяция вируса пополняется. Индивидуально активированные инфицированные Т-клетки «выживают» после инфекции и становятся латентными долгоживущими носителями вируса. Его реактивация дефектными частицами FIV и другими факторами снова приводит к активной репликации вируса. FIV также поражает В-клетки, макрофаги и дендритные клетки, микроглию и астроциты. Последующее действие вируса на иммунную систему достаточно сложное, неизученное, скорее всего, приводит к сильному подавлению иммунитета и активации иммунной системы.Иммунная система поддерживает жизненно важные функции ретровирусных вирионов с помощью определенных Т-хелперных белков и макрофагов. Виремия способствует выведению из крови лимфоцитов CD4 и Т-хелперов, что приводит к увеличению количества клеток-супрессоров CD8. Вирус иммунодефицита кошек совершенно не поддается нейтрализации. Активно будет развиваться виремия, на нее не повлияют даже сывороточные антитела. Сама иммунная система в это время характеризуется подавленным состоянием.Макрофаги достаточно устойчивы к апоптозу и удерживают вирус в себе до момента, когда организм сразу же погибнет. Вирус иммунодефицита легко проникает в макрофаги, так как для него требуется значительно большее количество молекул клеточной поверхности: хемокиновый рецептор CD4, корецептор CCR5 и белок внешней мембраны аннексин II, что облегчает ранние стадии проникновения вируса в клетку. В начальный период заражения вирус иммунодефицита не взаимодействует с геномом макрофага и не реплицируется. Благодаря макрофагам вирус проникает во все органы и ткани организма. Затем вирус передается Т-помощникам, которые становятся активными за счет презентации антигена основным комплексом гистосовместимости макрофагов. В то же время через некоторое время они ослабевают, и макрофаги выходят из-под «контроля» Т- и В-клеточной систем иммунной системы.Если вирусная нагрузка падает, начинается «бессимптомная» фаза, которая может длиться много лет или, возможно, всю жизнь. Считается, что на этом этапе репликация вируса контролируется иммунной системой, и инфицированные люди могут не проявлять клинических признаков. Однако исход инфекции FIV может быть разным. Вирусная нагрузка плазмы в бессимптомной фазе стабильна, но количество CD4 + Т-лимфоцитов все время снижается, что способствует изменению соотношения CD4: CD8 Т-лимфоцитов.Глава 2. Методы лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек: вирусологические, микроскопические, серологические и молекулярно – генетические2.1 Вирусологические методы исследованияРетровирусы кошек нечувствительны к куриным эмбрионам и лабораторным животным. Ретровирусы могут воспроизводиться во многих других культурах, несмотря на отсутствие некоторой степени цитопатического эффекта, и только в некоторых мы видим очаги трансформации и повреждения монослоя.Ранее лучшим методом диагностики считалось выделение вируса в культуре клеток. На ранних стадиях заболевания определение инфекционных частиц проводилось этим сверхчувствительным методом.Этот метод довольно сложен в использовании и практически нигде не применяется, поэтому сейчас создано много новых способов обнаружения вируса.FIV способен вызывать цитопатогенный эффект (ЦПЭ) при культивировании в культуре клеток. EPC проявляется в виде везикулярной дегенерации, повышенной гибели клеток и образования синцитиев через несколько недель после заражения. Первичные и трансплантируемые Т-лимфобластные клетки - и перевиваемая линия почечных клеток кошек - используются для выделения вируса. Вирус не реплицируется в других нелимфобластных клетках кошек, а также в культурах клеток человека, собак, мышей и т. Д.Увеличение количества вирусных клеток невозможно без белка vif. Если в штамме этот белок отсутствует, то о репликации CD4 + лимфоцитов и макрофагов не может быть и речи. Эти штаммы обладают уникальной функцией: они способны проникать в клетки-мишени, чтобы начать обратную транскрипцию. В этом случае провирусная ДНК синтезируется не полностью. Ген vif действует как детерминант репликации и инфекционности FIV. Фактором, ограничивающим продуктивную фазу репликации вируса иммунодефицита кошек в клетках, отличных от кошачьих, является белок, кодируемый геномом vif. Этот белок сверхэкспрессируется мутантными штаммами FIV, способными копировать себя в различных культурах клеток человека, что приводит к образованию синцитий.2.2 Микроскопические методы исследованияПри ретровирусных инфекциях животных для диагностических целей микроскопические методы исследования неадекватны. Поскольку вирусы имеют небольшие размеры - около 100 нм и не отличаются достаточно характерной морфологией.Атомно-силовая и электронная микроскопия широко используются для изучения вирусов, а также связанных с ними патологий.Электронная микроскопия считается более ранним методом, хотя до сих пор очень популярна. Благодаря наличию электронного микроскопа была детально исследована лучшая структура ретровирусов. За рубежом этот метод используют, когда возникают сомнения при постановке правильного диагноза.Атомно-силовая микроскопия (АСМ) - это разновидность сканирующей зондовой микроскопии. С помощью АСМ можно визуализировать буквально все, что связано со структурной вирусологией и организацией клеток. Несомненным преимуществом АСМ является то, что образцы исследуются как в жидкой среде (в культуральной среде или в буфере), так и на воздухе, как в свободном, так и в фиксированном состоянии. Между тем, он позволяет получать трехмерные изображения объекта. AFM - важный инструмент для измерения механических свойств биологических материалов; он используется для изучения различных типов материалов, отдельных молекул нормальных или злокачественных клеток.АСМ тесты вирусов в методах получения топографии поверхности тесты, такие как морфология частиц, особенности адсорбции вирусных частиц на поверхности (кинетика адсорбции, степень адгезии, взаимная ориентация частиц на поверхности), зависимость адсорбции от типа поверхности. (например, при модификации субстрата различными химическими соединениями), процессы кристаллизации вирусных частиц на поверхности, механическая прочность вирионов, а также отдельных белковых субъединиц, локализация генома внутри вирионов, а также такие процессы, как обработка и демонтаж вирусных частиц, высвобождение РНК (ДНК) из частиц, взаимодействие с клеткой-хозяином и т. д.Атомно-силовая микроскопия часто используется в биохимии и молекулярной биологии. При этом широкий диапазон размеров исследуемых объектов: от целых бактерий и клеток живых организмов до отдельных белковых молекул. Метод АСМ решает различные задачи: идентификация микроорганизмов по их морфологии, визуализация и контроль образования фермент-субстратных комплексов, изучение влияния различных веществ на жизнедеятельность клеток, контроль размеров, структуры и стабильности различных наноструктуры, необходимые для транспортировки лекарств, вязкости отдельных биомолекул и многого другого. ... Ученые находят новые применения гибких методов АСМ в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии.Этот метод используется для изучения антибактериальных свойств различных препаратов, например кишечной палочки, до и после лечения хитозаном с низкой и высокой молекулярной массой, биополимером с антисептической активностью.AFM позволяет вам видеть конформационные и структурные изменения в молекулах ДНК, когда они переходят в структурные части. Это позволяет изучить влияние различных внешних факторов, например УФ-излучения или излучения на саму молекулу, чтобы найти сайты связывания различных ферментов и кофакторов, которые активно проявляются в транскрипции и репликации ДНК.Через АСМ были представлены идеи о свойствах мембран лимфоцитов здорового человека и о линии раковых клеток Jurkat. Исследователи обнаружили, что средняя эластичность лимфоцитов почти вдвое выше, чем у раковых клеток линии Jurkat, а также обнаружили, что их субмембранные структуры были дестабилизированы.С помощью АСМ были выявлены адгезионные характеристики В-лимфоцитов человека, морфология и шероховатость клеток до и после воздействия на них агрессивных факторов бактериального происхождения. Это выявило увеличение средней шероховатости и средней высоты частиц в клеточной мембране, увеличение силы адгезии лимфоцитов.Вирусы MuLV и ВИЧ, уничтоженные с помощью детергентов или физически, были проанализированы с помощью АСМ, это было визуализировано, а также были детально изучены внутренние структуры вирусов.2.3 Серологическая диагностика ретровирусных инфекций кошекСегодня различают серологические тесты, идентифицирующие структурные белки и гликопротеины вирусов. Антитела в сыворотке крови животного определяют с помощью серологических тестов. Они используются для диагностики вирусов. В то же время специфичность наиболее распространенных тестов очень низкая, что является существенным недостатком для диагностики в странах с низкой распространенностью заболевания. В этом случае положительный результат в областях с низкой распространенностью необходимо еще раз проверить, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).Не забывайте, что высока вероятность ложных срабатываний. Бывает, что у животных уже есть провирус в крови (латентно инфицированный), при этом они очень долгое время являются серонегативными. Ложноотрицательные результаты также получаются на конечной стадии инфекции, что может указывать на наличие иммунодефицита или высокой вирусной нагрузки, поскольку может происходить секвестрация антител.Такие средства в России не производятся. Доступные сегодня тесты для диагностики этих заболеваний не делают различий между вакцинированными и инфицированными кошками. Это приводит к сложностям диагностики на вакцинированных территориях.Среди других методов, Вестерн-блоттинг (иммуноблот), признанный «Золотым стандартом» в диагностике инфекции ЭКО, часто используется для подтверждения противоречивых результатов. Иммуноблоттинг - это иммуноферментный анализ, который включает предварительный электрофоретический перенос вирусных антигенов на нитроцеллюлозную полоску (индикаторную полоску). Перед сероконверсией антитела выявляются более эффективно с помощью иммуноблоттинга, чем с помощью иммуноферментного анализа. Повторное обследование на наличие инфекции организма проводят через 3 и 6 месяцев. Наличие белков - продуктов вирусной экспрессии гена gag может вызвать неопределенную реакцию иммуноблоттинга. Если ситуация повторяется при проведении анализа через 6 месяцев, результат можно считать ложноположительным. Метод иммуноблоттинга также используется за рубежом для изучения биологии вируса иммунодефицита кошек, а также патогенеза, вызываемого инфекцией.Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (RNIF) считается первым методом выявления ретровирусов кошек в полевых условиях. Первыми разработали тест-систему для выявления вирусного лейкоза у кошек, а чуть позже - вирусного иммунодефицита у кошек.Сегодня существует две интерпретации метода. Первый характеризуется тем, что позволяет обнаруживать группоспецифический антиген в гранулоцитах, лимфоцитах и ​​тромбоцитах инфицированных животных (p27 с инфекцией FeLV). Образцы крови фиксируют ацетоном, а затем смешивают с антителами, содержащими маркеры флуорохромов. Если сравнивать этот метод диагностики с современными, то его чувствительность явно уступает. Положительный результат свидетельствует о стойкой виремии. Бывает, что антиген обнаруживается в плазме крови за короткое время до и после виремии. В этом случае, если степень инфицирования лейкоцитов периферической крови незначительна или имеется лейкопения, заболевание может остаться незамеченным.Другая модификация метода основана на обнаружении антител к антигену p24 FIV в сыворотке крови с использованием антигена, меченного флуорохромом. Таким образом, согласно Pedersen et al. (1987) использовали метод RNIF для обнаружения антител против вируса иммунодефицита у 10 из 25 кошек с клиническими проявлениями СПИДа и у 1 из 18 клинически здоровых кошек. Результаты исследования подтверждены электронной микроскопией.В настоящее время эти методы еще не получили широкого распространения, но все еще используются на практике.Первые тесты ELISA с использованием поликлональных антител позволили количественно определить вирусный трансмембранный белок, но дали ложноположительные результаты, поскольку антитела обнаруживают не только вирусные, но и невирусные белки. Расширенные тесты обладают высокой степенью специфичности и основаны на ИФА. Современные тесты ELISA обладают высокой диагностической чувствительностью (90%) и специфичностью (100%), но при диагностике ретровирусных инфекций из-за биологических характеристик возбудителей они должны быть подтверждены - наличие или отсутствие провирусной ДНК.Иммунная хроматография считается одним из самых популярных лабораторных тестов в нашей стране, используемых для выявления ретровирусных агентов. Такие свойства, как диагностическая чувствительность и специфичность этих экспресс-тестов, аналогичны характеристикам ELISA. Ценность заключается также в том, что, например, при ретровирусных инфекциях антитела могут быть определены немедленно как к FeLV, так и к FIV. Для этого не используется специальное оборудование, а на диагностику такого типа требуется не более получаса времени. Однако ICA имеет те же недостатки, что и ELISA, связанные с биологией ретровирусов.2.4Полимеразная цепная реакция в диагностике ретровирусных инфекций кошек: преимущества, недостатки, модификации методаПолимеразная цепная реакция (ПЦР) - один из молекулярно-генетических методов исследования биологических объектов. В отличие от других молекулярно-генетических методов, таких как лигазная цепная реакция, NASBA и др., Полимеразная цепная реакция имеет ряд преимуществ. ПЦР можно рассматривать как альтернативный метод молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК, в котором нет необходимости использовать сложные методологические приемы, используемые в генной инженерии для обычного клонирования.Метод ПЦР был опубликован и запатентован в 1985 году К.Б. Муллисом и оказал огромное влияние на многие области исследований и прикладного использования нуклеиновых кислот. За это открытие в области молекулярной биологии и генетики исследователь семь лет спустя получил Нобелевскую премию по химии. Благодаря открытию ПЦР стало возможным амплифицировать любой фрагмент ДНК, если его нуклеотидная последовательность известна. Это великое открытие позволило расширить возможности молекулярной генетики в большей части генной инженерии до такой степени, что радикально изменило и усилило научный потенциал ее различных областей.В мире и в России именно полимеразная цепная реакция признана самой популярной для обнаружения провирусной ДНК. Этот метод позволяет выявлять как вирусоносителей, так и больных ретровирусными инфекциями кошек. Метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, но при этом дает возможность автоматизации процессов. Одним из основных преимуществ ПЦР является ее уникальная способность учитывать важные свойства ретровирусов кошек:- способность к длительной персистенции без выраженного иммунного ответа и вероятность антигенной изменчивости.При обнаружении инфекции FeLV ПЦР в реальном времени называется «золотым стандартом». В каждой клетке тела кошки можно найти от 12 до 15 копий эндогенного генетического материала FeLV, что затрудняет определение наиболее специфической последовательности непосредственно для экзогенного провируса. ПЦР в реальном времени позволяет анализировать количество провирусов в лимфоцитах периферической крови, что позволяет делать более точный прогноз при выборе методов терапии для животного.ПЦР для обнаружения провируса требуется кошкам с отрицательным результатом иммунохроматографического анализа, подозревающим наличие ретровирусной инфекции. ПЦР выявляет как латентных носителей, так и животных с иммунной системой, «истощенной» ретровирусами.Процесс основан на том, что определенный участок ДНК выборочно копируется снова в искусственных условиях с помощью ферментов. Копирование происходит только в том случае, если оно присутствует в тестовом шаблоне. Относительно короткие сегменты ДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР.Для проведения ПЦР требуются неотъемлемые компоненты:- ДНК-матрица, обязательно содержит участок ДНК, который необходимо амплифицировать.- Двапраймера,которыекомплементарныпротивоположнымконцам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.- ДНК-полимераза - фермент, без которой невозможно представить реакцию полимеризации ДНК- Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).- Ионы Mg2+, обеспечивающие активность полимеразы.- Буферный раствор, поддерживающий pH смеси на протяжении всей реакции, ионную силу раствора, содержащего соли бычьего сывороточного альбумина.Использование масла с высокой температурой кипения считается обязательным, это защитит реакционную смесь от испарения, если на приборе для ПЦР не предусмотрена подогреваемая крышка.Специфичность ПЦР характеризуется образованием комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицированной области.ПЦР проводится в термоциклере, который способен охлаждать и нагревать пробирки со смесью с заданным интервалом времени. Современные усилители используют сложные программы и предлагают множество исследовательских возможностей. Инструменты доступны с автоматической крышкой и отсеком для микропланшетов для легкой интеграции в автоматизированные системы.Если исследуемый образец содержит желаемую ДНК, происходит ее амплификация, каждый цикл которой проходит в определенном температурном диапазоне. Любой тип усиления проходит в три этапа:1. Денатурация - это процесс разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований под воздействием высоких температур, в результате чего в белке происходит пространственное изменение, ДНК превращается из двухцепочечной в одноцепочечную форму.2. При отжиге праймеры прикрепляются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбираются так, чтобы они сужали желаемый сайт и были комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом дополнительности Чаргаффа, что является важным условием, поскольку ПЦР невозможен без его реализации.Гель-электрофорез часто используется для того, чтобы сделать видимым определенный фрагмент ДНК.3. Удлинение (синтез). После отжига праймеров полимераза Taq начинает удлинять вторую цепь ДНК от 3'-конца праймера.Для того чтобы полимераза Taq могла начать синтез второй цепи ДНК как можно эффективнее с 3 'конца праймера, который связан с матрицей и перемещается в направлении от 3' к 5 ', необходимо для создания оптимальной температуры в системе.Цикл повышения температуры повторяется 30 или более раз. С каждым циклом количество синтезированных копий фрагмента ДНК увеличивается вдвое. Впервые в конце второго цикла можно наблюдать специфические фрагменты, ограниченные конечностями праймерами, которые экспоненциально увеличиваются и вскоре превалируют по количеству среди продуктов амплификации.В настоящее время ПЦР-диагностика стремительно развивается. Сам метод совершенствуется, появляются новые разновидности ПЦР, на медицинском рынке появляются новые тест-системы на эту реакцию.В простых случаях принципы, основанные на классических протоколах ПЦР, разработанных К.Б. Mullis et al. Показываю отличные результаты. Метод оптимален для амплификации коротких последовательностей любых последовательностей в гомогенных векторных молекулах на основе плазмид и хромосом бактериофагов.Если реакционная смесь содержит несколько пар праймеров, которые будут специфичными для разных генетических локусов, это позволяет одновременную амплификацию соответствующих участков матрицы ДНК. Такая система ПЦР называется мультиплексной ПЦР или мультиплексной. Этот метод используется, когда условия реакции оптимальны для всех пар праймеров.В настоящее время метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (в реальном времени) очень популярен как в клинической генодиагностике, так и в научных исследованиях.Такой способ проведения реакции характеризуется изменением сигнала флуоресценции в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала напрямую зависит от концентрации конечного продукта ПЦР. Одно из главных преимуществ - синхронизация регистрации и усиления. Это определяет кинетику процесса, которая часто прямо пропорциональна начальному количеству исследуемой ДНК. Поставляемое программное обеспечение позволяет автоматически определять концентрацию исследуемого патогена, что многократно снижает трудовые и энергетические затраты, а также является наиболее эффективным в режиме реального времени по сравнению с другими количественными методами ПЦР-диагностики. При этом оборудование, с помощью которого можно проводить этот вид диагностики, стоит около 2 миллионов рублей, что может стать существенным фактором, если ветеринарные лаборатории и больницы откажутся от их использования.Все модификации ПЦР направлены на обнаружение ДНК. Однако бывает, что иммунная система кошек преодолевает виремию, но, тем не менее, они будут положительными на наличие провирусов. В то же время вирус не будет присутствовать в крови, слюне и кале этих животных, соответственно, их эпизоотическая роль и прогноз при лечении будут отличаться от таковых у кошек с виремией. Способность обнаруживать вирусную РНК стала важным аспектом диагностики ретровирусов кошек. РТ-ПЦР или ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) состоит из предварительной обработки образца ревертазой, которая приводит к переносу всей РНК на кДНК, которая затем обнаруживается с помощью ПЦР в одной из ее модификаций. Этот тест может обнаруживать и количественно определять вирусную РНК в цельной крови, сыворотке, плазме, слюне или стуле. При этом чувствительность анализа настолько высока, что можно обнаружить зараженную кошку в 30 объединенных пробах.Между тем, ПЦР обладает большим набором преимуществ, которые позволяют ему быть более конкурентоспособным в сравнении с традиционными микробиологическими методами:- Скорость и высокая производительность.На весь процесс ПЦР - анализа от момента поступления образца до получения уже окончательного результата требуется обычно не более одного рабочего дня.- Высокая специфичность.Он рассчитывается по уникальности генетического материала каждого вида микроорганизмов. При использовании праймеров, комплементарных определенной последовательности ДНК и соблюдении определенного режима, амплифицируется только ДНК желаемого вида, даже если в образце присутствует другая ДНК, например ДНК других микроорганизмов.Обладая узкой направленностью, ПЦР способна выявлять определенного возбудителя, что несомненно можно отнести к плюсам.- Высокая чувствительность.Одной копии желаемой последовательности ДНК (РНК) в исследуемом образце достаточно, чтобы запустить эту реакцию. Чувствительность 0,51 микроорганизмов на образец вполне реальна для ПЦР, что позволяет использовать ее даже в том случае, если серологические и бактериологические тесты не дают положительного результата из-за низкого титра микробов. Эта чувствительность требует нового подхода к клинической интерпретации лабораторных результатов.Более того, такое уникальное свойство иногда может стать серьезным недостатком. Речь идет о гиперчувствительности ПЦР к загрязнению чужеродными молекулами ДНК, которые служат мишенью для используемого набора праймеров. Даже присутствие одной загрязняющей молекулы ДНК в образце может служить множеством копий во время процесса ПЦР, это приводит к целевому продукту ДНК, что может привести к ложноположительному результату.В связи с угрозой получения ложноположительных результатов необходимо строго соблюдать требования и особые подходы, направленные на снижение риска заражения ПЦР.Еще одна проблема - возможность получения ложноположительного результата. Чрезмерную чувствительность ПЦР можно снизить, подавив реакцию компонентов биологических образцов.Серьезным недостатком описанного метода является выбор конкретных методов подготовки клинических образцов для исследования с помощью ПЦР. На сегодняшний день не существует конкретного подхода к выделению ДНК разных типов микроорганизмов из разных источников. Быстрые методы, представляющие собой автоматизированный процесс, не всегда обеспечивают необходимый уровень чувствительности. А многоступенчатые методы очистки и концентрирования микробной ДНК для ПЦР-анализа более трудозатратны и увеличивают вероятность загрязнения образца.Существует вероятность получения ложноотрицательного результата, если искомая последовательность, праймеры которой комплементарны, изменилась. Для ретровирусных инфекций это особенно важно, так как эти вирусы имеют высокую вероятность мутаций, что связано с особенностями строения и биологии возбудителей. Каждый год от кошек выделяют новые типы и подтипы вирусов иммунодефицита. Поэтому необходимо регулярно обновлять методологию, проверяя комплементарность праймеров геномам описанных выше штаммов. При отсутствии комплементарности достаточно заменить праймеры в системе.Не забывайте, что этот метод диагностики стоит дорого. Требуется обширное лабораторное оборудование, которое может себе позволить не каждая практикующая лаборатория. В настоящее время ПЦР можно считать незаменимым средством диагностики многих инфекционных заболеваний. Внедрение этого метода на практике во всех лабораториях возможно за счет совершенствования самой технологии.ЗаключениеСогласно литературным данным и результатам собственных исследований ретровирусы широко распространены в популяции кошек. Чтобы эффективно контролировать распространение ретровирусов, необходимо учитывать особенности биологии возбудителей: особенности их взаимодействия с макроорганизмом, механизм патогенетического воздействия и развития инфекционного процесса, особенности эпизоотические симптомы и многие другие факторы.Благодаря высокому адаптивному потенциалу ретровирусы распространились повсеместно. В эндемичных регионах уровень инфицирования восприимчивых организмов составляет 100%.Иммунная система - одна из важнейших гомеостатических систем организма, в значительной степени определяющая здоровье людей и животных и их приспособляемость. Ретровирусы выбрали их местом своего паразитизма. Медленно, но верно они его расстраивают, уничтожают, а вместе с ним и зараженный организм, делая его восприимчивым ко всем агрессивным факторам внешней и внутренней среды.Диагностика, в том числе дифференциальная, несомненно, играет огромную роль в ретровирусной патологии. Важно своевременно выявлять зараженных животных, чтобы уберечь здоровых животных от заражения. При лейкемии у кошек поможет вакцинация, а при иммунодефиците поможет только изоляция. Необходимо защищать не только животных, но и людей. Животные, инфицированные вирусом лейкемии, представляют опасность для определенных категорий людей, поскольку FeLV потенциально опасен для человека.Список используемой литературы1.Анализ инфицированности кошек ретровирусными инфекциями в Саратовской области / Ю.А. Марушева, О.С. Ларионова, А.В.Красников, Ю.А. Марушева // Аграрный научный журнал –2015 – №2 – стр. 14–16.2.Бажибина Е.Б., Бажибина В.А. Мониторинг результатов лабораторных исследований кошек – носителей хронических вирусных инфекций / Е.Б. Бажибина, В.А Бажибина // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. –2016. – № 3. – С. 6–83.Бажибина, Е.Б. Алгоритм диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний кошек / Е.Б. Бажибина // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. – 2011. - №2. – С. 4 – 12.4.Бажибина, Е.Б. Лейкемия и иммунодефицит – скрытые вирусные инфекции кошек /Е.Б. Бажибина, Ю.Б. Соколова // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. – 2010. – №1. – С. 14 –17.5.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак// Пер. с англ. — Москва: Мир, 2002. —589 с.6.Золототрубов, А. П. Эпизоотология и профилактика ретровирусных инфекций кошек / А. П. Золототрубов // Ветеринарная патология. – 2007. – №3. – С. 153–155.7.Зорина В.В Основы полимеразно цепной реакции / В.В Зорина // Методическое пособие. – Москва – 2012.8.Красникова, Е.С. Изучение структурно-функционального состояния лимфоцитов здоровых и FeLV-инфицированных кошек методом атомно-силовой микроскопии / Е.С. Красникова, О.В. Столбовская, Д.А. Артемьев, Б.Б. Костишко// Научная жизнь. – 2014. – №6. – С. 156–162.9.Лопухов, Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л.В. Лопухов, М.В. Эйнштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – № 3 – Том 2. С. 16–19.10.Марушева, Ю.А. Изучение вязко-эластических и топографических свойств мембран лимфоцитов при FIV и FeLV-инфекции / Ю.А Марушева, Д.А. Артемьев // Современные тенденции сельскохозяйственного производства в мировой экономике: материалы XV Международной научно-практической конференции. - Кемерово: ФГБОУ ВО «Кемеровский ГСХИ»., 2017. - С. 271-275.11.Марушева, Ю.А. Клинический случай диагностики СПИДа у кота / Ю.А Маршева, А.С. Белякова // Молодежь и наука XXI века: Материалы IV Международной научно-практической конференции: сборник научных трудов. - Том I.- Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2014. - С. 73-77.12.Марушева, Ю.А. Определение роли бродячих кошек в эпизоотическом процессе при FIV-инфекции / Ю.А. Марушева, А.С. Белякова // Вестник АПК Ставрополья. -№ 1. – 2015. - С. 75-78.13.Марушева, Ю.А. Разработка нового способа молекулярно-генетической детекции FIV у кошек больных СПИДом / Ю.А Марушева, А.С.Белякова // Новые материалы и технологии: состояние вопроса и перспективы развития: сборник материалов Всероссийской молодежной научной конференции. – Саратов: СГТУ, 2014 - С. 191-195.