Биосенсоры как технические системы

Введение
В последнее десятилетие возникли новые контакты на первый взгляд между очень далекими областями: электроникой и биохимией. Их взаимное проникновение друг в друга создало новую сферу интересов науки – биоэлектронику. Первым шагом в этой области было возникновение новых устройств для анализа и переработки информации, получивших название биосенсоров. Биосенсоры рассматриваются как первое поколение биоэлектронных устройств.Биосенсоры – это аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала.Идея создания такого рода устройств существует уже около 30 лет. Впервые ее высказали Кларк и Лионс в 1967 году. Идея Кларка состояла в использовании ферментного электрода, то есть электрохимического датчика с иммобилизованным на его поверхности ферментом. За прошедшие десятилетия эта идея получила достаточное развитие. Создано и исследовано много систем, некоторые получили апробирование и промышленную реализацию.Биосенсоры как новые аналитические устройства, позволяющие получать и перерабатывать экспресс-информацию о химическом составе тех или иных объектов, находятся в начале своего развития. Можно ожидать существенного вклада этих биоэлектронных устройств в повышение качества медицинских анализов, контроля технологических процессов, оценки качества пищевых продуктов и окружающей среды.1. Определение Сенсором называется устройство, преобразующее информацию о наличии специфического химического соединения (аналита) в удобный для преобразования (детектируемый) сигнал.В общем случае сенсор содержит два компонента – рецепторную систему химического распознавания (рецептор) и преобразователь сигнала (трансдьюсер), основанный на химическом или физическом принципе.Таким образом, биосенсоры – это вид сенсоров, в которых система распознавания имеет биохимическую природу и основана на реакциях с участием биомолекул либо надмолекулярных биологических структур. В биосенсорах система распознавания находится в непосредственном контакте с преобразователем сигнала (рис. 1) [ REF _Ref97553440 \r \h 2]. Рисунок SEQ Рисунок \* ARABIC 1. Принципиальная схема биосенсора Одним из главных требований, предъявляемых к биосенсорам, является селективность биорецептора к специфичному целевому аналиту и способность сохранять селективность при наличии других веществ в пробе. Селективность зависит от способности биорецептора связываться с аналитом. Высокоселективные системы биологического распознавания разрабатываются с использованием биорецепторов биологического происхождения (антитела, лиганды и др.) или созданных по образу биологических систем (искусственные распознающие элементы: аптамеры, пептиды, полимеры, полученные методом молекулярной печати). Другое важное требование, предъявляемое к биосенсорам, – чувствительность. Чувствительность зависит от множества факторов, включая геометрию сенсорной (чувствительной) поверхности, свойств материала сенсора, химических свойств поверхности, используемой для иммобилизации биорецепторов [ REF _Ref97553707 \r \h 1].При классификации важно разделять биосенсоры и аналитические системы, требующие дополнительные стадии пробоподготовки и разделения пробы (различные виды хроматографии, проточная цитометрия и пр.).2. Биосенсоры как технические системыПроведение мероприятий экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга является актуальной проблемой для различных отраслей пищевой промышленности, клинической медицины и экологии (рис. 2) [ REF _Ref97553440 \r \h 2].Рисунок SEQ Рисунок \* ARABIC 2. Использование биосенсорных систем в различных сферах деятельностиВ настоящее время усилия разработчиков биосенсорных систем направлены на интеграцию биосенсоров в сложившуюся систему детектирования возбудителей инфекционных заболеваний, традиционно включающую методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), методы подсчёта колоний микроорганизмов и иммунологические методы.Методы подсчёта колоний микроорганизмов и культуральные методы продолжают оставаться стандартом для микрообиологических исследований, несмотря на их трудоёмкость и длительность получения результата. Так, в случае специфического анализа на Campylobacter spp. время получения отрицательного результата составляет 4–9 дней, а для подтверждения положительного результата необходимо ждать 14–16 дней [ REF _Ref97553440 \r \h 2]. Как правило, такие сроки неприемлемы для клинических исследований и анализа в различных отраслях промышленности. Для дифференциальной диагностики патогенных микроорганизмов используют селективные среды культивирования. Подобные среды могут содержать ингибиторы для подавления роста нецелевых видов микроорганизмов или специфические субстраты, подходящие для роста определённых микробов (например, радужный агар для выявления Salmonella spp.) [ REF _Ref97554585 \r \h 3]. Анализ осуществляется с помощью оптических методов и визуального осмотра колоний.Иммунологические методы остаются одним из наиболее мощных аналитических инструментов обнаружения микроорганизмов при решении различных задач. Помимо традиционных методов (реакция геммаглютинации, иммуноферментный анализ, различные варианты иммунохроматографии) в арсенале современных иммунологических методов находится иммуномагнитная сепарация (IMS), комбинируемая с различными методами детектирования [ REF _Ref97553440 \r \h 2].Полимеразная цепная реакция основана на технологии амплификации нуклеиновых кислот, которая была предложена в средине 80-х гг. ХХ века. Технология базируется на выделении, амплификации и определении количества копий коротких фрагментов ДНК, содержащихся в геноме выявляемого микроорганизма. В настоящее время существуют различные варианты постановки амплификационного анализа: ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), мультиплексная ПЦР (мПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [ REF _Ref97553440 \r \h 2].Существует несколько классов биологических рецепторов, которые используются в биосенсорных системах. Основными классами рецепторов являются ферменты, антитела и нуклеиновые кислоты. При этом в ходе обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний прослеживается тенденция использования ферментов преимущественно в качестве меток, а не специфических элементов распознавания бактерий. Ферменты используются для маркировки антител и ДНК-зондов, как это имеет место в ходе традиционного иммуноферментного анализа. Большая часть коммерчески доступных биосенсоров содержит в своём составе маркированные ферментами антитела. В зависимости от способа получения антитела классифицируются на моноклональные, поликлональные и рекомбинантные. От класса, к которому относятся антитела, зависит также их селективность.3. Основные типы биосенсоровСуществует несколько способов классификации биосенсоров: по способу детектирования целевого аналита; по типу используемых биорецепторов; по механизму преобразования сигнала.В настоящее время используются две группы способов детектирования целевого аналита: с использованием специальных меток и красителей (label-based), без использования специальных меток и красителей (label-free). Перечень методов детектирования, которые могут использоваться для обоих случаев, представлен в таблице 1. В зависимости от природы сигнала и механизма его преобразования биосенсоры можно классифицировать на следующие группы: механические, оптические, электрические, пьезоэлектрические, электрохимические, термальные (табл. 2).Таблица SEQ Таблица \* ARABIC 1. Классификация биосенсоров в зависимости от наличия специальных меток и красителейДетектирование с меткойБезметочное детектированиеоптическоемеханическоеэлектрическоеELISA;FRET;Использование квантовых точекповерхностный плазмоновый резонанс;интерферометрия;эллипросометрия;метод резонансного зеркалаиспользованиекантиливера;использованиенаномеханического осциллятора;метод микробаланса кварцевого кристалла использованиеполевых транзисторов (ISFET, EnFET, HFET, NanowireFET);использование микрофлюидных электрохимических устройств (PED)Таблица SEQ Таблица \* ARABIC 2. Классификация биосенсоров в зависимости от способа преобразования сигнала и используемых методов детектированияМеханизм преобразованияМетодМеханическийизменение/определение поверхностного напряжения.изменение/определение массы.изменение/определение резонансной частотыОптическийфлуоресценция.хемолюминесценция.биолюминесценция.поверхностный плазмоновый резонанс.рассеивание.интерферометрия затухающих волн.Электрическийопределение проводимости.определение ёмкости.определение сопротивленияПьезоэлектрическиймикробаланс кварцевого кристала (QCM).поверхностная акустическая волнаЭлектрохимическийпотенциометрия.вольтамперометрия.использование ион-селективного полевого транзистора (ISFET).использование химически чувствительного полевого транзистора (ChemFET)ТермальныйкалориметрияЭлектрические и электрохимические биосенсоры основаны на измерении электрических величин, которые изменяются в системе при взаимодействии между рецептором и аналитом.Потенциометрические сенсоры формируют аналитический сигнал как разность потенциалов между рабочим электродом и электродом сравнения, иммобилизованными в полупроницаемую мембрану. При этом ионселективный электрод (ISE) используется в качестве преобразователя/усилителя сигнала. Наиболее распространённый тип потенциометрических сенсоров – это рН-электроды [ REF _Ref97553440 \r \h \* MERGEFORMAT 2].Вольтамперометрические сенсоры позволяют осуществлять обнаружение аналитов, участвующих в окислительновосстановительных реакциях. Между рабочим электродом и электродом сравнения устанавливается фиксированная величина разности потенциалов, после чего осуществляют контроль за изменением напряжения в цепи, которое пропорционально концентрации одного из продуктов аналитической реакции [ REF _Ref97555404 \r \h 4].Кондуктометрические сенсоры осуществляют измерение проводимости раствора в ходе протекания аналитической реакции. Кондуктометрические сенсоры мало пригодны для использования в каталитических реакциях, но широко применяются в реакциях, где осуществляются аффинные взаимодействия.Импедансные сенсоры основаны на измерении сопротивления в электрохимической ячейке или на фиксировании изменения сопротивления при варьировании вольтамперметрических характеристик.Сенсоры на основе полевых транзисторов основаны на использовании ион-селективных электродов в традиционных потенциометрических системах, при этом входной транзисторный элемент помещается в анализируемый раствор. Это существенно повышает разрешающую способность и улучшает аналитические возможности биосенсора. Чувствительный слой биосенсора располагается непосредственно на поверхности ион-селективного электрода, представляя собой ворота полевого транзистора. Использование подобных биосенсоров даёт возможность непосредственного обнаружения коротких белков и пептидов по величине их заряда [ REF _Ref97553440 \r \h 2].Существенным ограничением при использовании электрических и электрохимических биосенсоров является чувствительность аналитических систем к буферной ёмкости раствора.В коммерчески доступных биосенсорных системах для выявления возбудителей инфекционных заболеваний наибольшее распространение получили биосенсоры на основе оптических и электрохимических методов.Биосенсоры можно классифицировать на два типа в зависимости от биорецептора (табл. 3): аффинные и каталитические. Таблица SEQ Таблица \* ARABIC 3. Классификация биосенсоров в зависимости от типа рецептораРецепторТип биосенсораФерментАффинный / КаталитическийАнтитело / АнтигенАффинный (иммуносенсор)Нуклеиновые кислоты / ДНККаталитическийИскусственный (синтетические) биоматериалАффинныйКлеточные структуры / КлеткиКаталитическийИонофорАффинныйАффинные рецепторы не влияют или не изменяют целевой аналит (биомаркер), в то время как каталитические рецепторы катализируют биохимическую реакцию. Большинство ферментов относятся к каталитическим рецепторам. В случаях, когда ферменты не дают возможности обнаружить требуемые биомолекулы, прибегают к использованию антител, как высоко селективных рецепторов.Наиболее широко используемыми биорецепторами являются: антитела, ферменты, нуклеиновые кислоты, искусственные (синтетические) биораспознающие элементы. Для формирования аналитического сигнала в биосенсорах используют такие методы иммобилизации биологического аналита, как физическая адсорбция, ковалентное связывание, встраивание в матрицу, перекрёстное межмолекулярное связывание, мембранное связывание и инкапсулирование , как это представлено на рисунке 4.Рисунок SEQ Рисунок \* ARABIC 3. Способы иммобилизации биорецепторов в подложке 1 – физическая адсорбция; 2 – ковалентное связывание; 3 – встраивание в матрицу из полимерного геля; 4 – перекрестное межмолекулярное взаимодействие; 5 – инкапсулирование в пористую матрицуФизическая адсорбция основана на совместном действии Ван-дер-Ваальсовых, гидрофобных, водородных и ионных сил, вызывающих прикрепление биологического рецептора к поверхности сенсора. Для иммобилизации биомолекул широко используются подложки из целлюлозы, стекла, гидроксиапатита и коллагена. Хотя реализация метода физической адсорбции довольно проста, образующееся взаимодействие является слабым и биомолекула с лёгкостью отделяется от подложки. Ковалентное связывание предполагает модификацию поверхности сенсора, в результате которой образуются активные группы, способные эффективно связываться с рецепторными молекулами. В случае, когда рецептором биосенсора выступает фермент, иммобилизация осуществляется через функциональные группы, которые не являются существенными для ферментативной активности. Как правило, это нуклеофильные группы (амино-, карбоксильные, имидазольные, тиольные, гидроксильные). Ковалентное связывание позволяет решить проблемы нестабильности биомолекул, агрегации и диффузии, что даёт возможность получать биосенсоры с хорошими показателями плотности и равномерности распределения биорецепторов на поверхности сенсора.Встраивание в матрицу из полимерного геля также позволяет закрепить биорецепторы на подложках. Для реализации данного способа подходят гелевые матрицы, содержащие полиакриламид, крахмал, поливиниловый спирт, поливинилхлорид, поликарбонаты, ацетат целлюлозы и силикагель. Со временем происходит вымывание биорецепторов из матрицы, что сопровождается снижением сенсорной активности.Перекрестное межмолекулярное взаимодействие биомолекул с бифункциональными и мультифункциональными реагентами, такими, как глутаровый альдегид, гексаметилендиизоцианат, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол также используется для иммобилизации рецепторов на поверхности биосенсора. Недостатком данного способа является то, что образуемый активный участок является неоднородным и может включать несколько рецепторных слоев, образующих диффузионный барьер. Инкапсулирование в пористую матрицу осуществляется с использованием системы «золь-гель». В качестве пористой матрицы используется оксид кремния, который даёт возможность использования оптических методов визуализации сигналов с поверхности биосенсора. Процессы в системе «золь-гель» протекают при комнатной температуре, что предотвращает денатурацию биомолекул, а образующиеся структуры обладают высокой стабильностью.Иммобилизация биомолекул на поверхности является одним из ключевых этапов создания биосенсоров, в ходе которого необходимо учитывать целый ряд эксплуатационных требований. Это обеспечение функциональной активности и стабильности биомолекул, предотвращение химической инактивации. В связи с этим не существует универсальной стратегии иммобилизации и её приходится подбирать индивидуально с учётом особенностей биорецептора, матрицы, преобразователя сигнала и свойств пробы, которую предполагается анализировать.При создании биосенсоров для выявления патогенных микроорганизмов наибольшее распространение получили следующие способы иммобилизации рецептора.Адсорбция на поверхности золота – является достаточно простым и быстрым способом иммобилизации, который предполагает прикрепление антител к субстрату в случайном порядке, без направленного пространственного ориентирования. Так как адсорбция рецепторов на поверхности золота является неспецифической, аналитические характеристики сенсора редко бывают высокими.Авидин-биотиновые системы – позволяют быстро и надёжно прикрепить биорецепторы к покрытой авидином поверхности. Хотя константа аффинного взаимодействия между авидином и биотином является довольно высокой (10-15 моль-1 . л), само взаимодействие имеет нековалентную природу, что позволяет осуществлять множественную отмывку поверхности сенсора и использовать его повторно. К числу недостатков авидин-биотиновых систем относят высокую стоимость реагентов [ REF _Ref97555404 \r \h 4].Монослойные структуры, способные к самосборке (self-assembled monolayers – SAMs), получают при эмульгировании плоских микрочастиц золота в растворителе в присутствии поверхностно-активных веществ (ПАВ). Наибольшее распространение в качестве растворителя получили системы на основе этанола с добавками дисульфидов или тиолов. Формирование и взаимодействие монослоёв осуществляется при реакции радикалов с сульфидными группами. Присоединение биорецептора происходит посредством тиольной группы. Таким образом, аналитические возможности биосенсорных систем достаточно широки, что открывает возможности для их применения при проведении мероприятий экологического мониторинга.4. Области применения биосенсоровРасширение сферы применения биосенсоров в настоящее время обусловлено не только высокой чувствительностью этих систем, но и тем, что биосенсор, как правило, содержит весь набор реагентов, необходимых для определения концентрации какого-либо вещества, а это позволяет свести процедуру анализа к одному этапу. Можно говорить о своего рода автоматизации определения химических параметров тестируемых образцов, поскольку структура сенсоров, создаваемых методами биотехнологии, реализует алгоритм биохимического анализа.В последние годы наблюдается быстрый рост областей использования биосенсоров, особенно в экологии и медицине. Это обусловлено как появлением новых прогрессивных технологий, так и, увеличением объема продаж биосенсорной продукции. Развитие рынка биосенсоров зависит от степени надежности и адекватности количественных методов, определения аналитов, представляющих экологический и клинический интерес, от совместимости биосенсорных технологий с крупномасштабными методами производства, от технической грамотности потребителей при работе с биосенсорами.В экологии биосенсоры используются для мониторинга параметров окружающей среды . Например, биосенсор для определения химического состава сточных вод. Датчик позволяет определять концентрации органических веществ в воде и детектировать наличие в среде гербицидов и мутагенов. Для определения концентраций фосфорорганических пестицидов на основе электрода Кларка разработаны биосенсоры, в которых чувствительным биологическим элементом является иммобилизованная в целлюлозную мембрану холиноксидаза либо бутирилхолиноксидаза. Разработаны амперометрические микробные биосенсоры, в которых уровень загрязнения окружающей среды определяется по влиянию вредных веществ на дыхание микробной компоненты .В медицине биосенсоры применяются при биохимическом скрининге жидких сред организма во время массовых обследований, для непрерывного мониторинга физиологических параметров больных, как первичные датчики при разработке систем биохимического протезирования . Спектрофотометрические и хроматографические методы, которые традиционно используются в клинике для определения органических веществ, малопригодны для измерений в режиме on-line. Этим обусловлены интенсивные исследования и разработки биосенсоров на физиологически значимые соединения, ответ которых составлял бы минуты, а при использовании кинетических методов – секунды. Такие датчики можно будет применять для непрерывного контроля биохимических показателей жидких сред организма. Например, разрабатываются имплантируемые ферментные датчики на глюкозу , которые предполагается использовать при лечении диабета с помощью компенсаторных устройств, управляемых микропроцессорами, поддерживающих нормальную концентрацию инсулина в крови .

Заключение

Современные биосенсорные устройства позволяют производить анализ широкого спектра низко- и высокомолекулярных соединений.Чувствительность в определении некоторых веществ лежит в диапазоне пикомолярных концентраций. Поскольку регистрация реакций тест-объекта производится при непосредственном контакте его с преобразователем, время анализа невелико и обычно составляет секунды или минуты. В последнее время биосенсоры получают дополнительную популярность в связи с тем, что они дают возможность проводить комплексные анализы вдали от крупных централизованных учреждений (например, сложные биохимические анализы для медицинских целей). Биосенсорные устройства уже используются в различных отраслях науки и промышленности.В настоящее время большая часть коммерчески доступных (производимых промышленно или малыми партиями) биосенсоров создана на основе ферментов (белков) или бактерий. Что же касается работ, описывающих применение молекул других биополимеров для создания биодатчиков биосенсорных устройств, то число их ограничено.Дальнейшее совершенствование биосенсорных устройств будет идти по следующим основным направлениям: расширению спектра биологических тестирующих элементов, совершенствованию методов стабилизации их свойств и разработке надежных датчиков тест-реакции.Последняя задача выходит за рамки биологической науки. Однако создание биосенсоров как раз и относится к области междисциплинарных исследований.

Список литературы

Биосенсорные системы в медицине: экспертный обзор / Аксенова Е. И., Камынина Н. Н., Маклакова Ю. А.– М.: ГБУ «НИИОЗММ ДЗМ», 2020. – 20 с.Биосенсоры для осуществления мероприятий экологического мониторинга: классификация и особенности разработки / Д. Л. Поклонский, О. Ю. Дурилов, Д. А. Зыгин [и др.] // Теоретическая и прикладная экология. – 2017. – № 4. – С. 12-19.Карякин А. А., Уласова Е.А., Вагин М.Ю., Карякина Е.Е. Биосенсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики // Сенсор. 2015. № 1. С. 16–23Andryukov B.G., Lyapun I.N., Matosova E.V., Somova L.M. Biosensor technologies in medicine: from detection of biochemical markers to research into molecular targets (review). Sovremennye tehnologii v medicine 2020; 12(6): 70–85, Waller D.F., Hew B.E., Holdaway C., Jen M., Peckham G.D. Rapid detection of Bacillus anthracis spores using immunomagnetic separation and amperometry. Biosensors (Basel) 2016; 6(4): 61