Применение метода тонкослойной хроматографии для анализа лекарственных форм

ВВЕДЕНИЕ

В фармацевтической промышленности с целью обеспечения эффективности и безопасности лекарственных средств активно используются современные хроматографические методы анализа [1, 3].Хроматографией называется метод разделения веществ на составляющие ее компоненты, основанный на различной скорости движения веществ в потоке подвижной фазы (элюента) вдоль слоя неподвижной фазы, причем исследуемые соединения распределены между обеими фазами [6]. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую хроматографию, которую разделяют на газоадсорбционную и газожидкостную хроматографии; жидкостную хроматографию [3, 6].По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы различают колоночную и планарную (плоскостную) хроматографию. В первом случае сорбенту придают форму цилиндра; перемещение подвижной фазы происходит вдоль оси этого цилиндра. Во втором - сорбент размещается параллельно определенной плоскости, и движение элюента в нем происходит параллельно этой плоскости. В колоночной хроматографии обычно выделяют капиллярную хроматографию. Наиболее распространенным видом колоночной хроматографии является высокоэффективная жидкостная хроматография. К плоскостности (планарной) относятся тонкослойная хроматография и хроматография на бумаге [1, 6].По механизму разделения различают ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, осадительную хроматографию, аффинную хроматографию, адсорбционную хроматографию и распределительную хроматографию [1, 6].В зависимости от выполняемых задач хроматография бывает:1) аналитической, когда производится исследование физико-химических характеристик веществ при использовании хроматографических приборов и на основании параметров хроматографических зон;2) препаративной, используемой для выделения небольших количеств чистых компонентов в лабораторных условиях;3) промышленной, применяемой для получения чистых веществ в значительных количествах [5, 6].ОСНОВНАЯ ЧАСТЬХарактеристика тонкослойная хроматография как современного метода фармацевтического анализа Тонкослойной хроматографией или хроматографией в тонком слое сорбента называют хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (пластинку) из соответствующего материала - стекла, металла или полимера [3, 6].Разделение может осуществляться по различным механизмам: адсорбционному, распределительному, ионообменному или какой-либо их комбинации [6].Хроматографическое разделение осуществляется в результате движения анализируемых веществ в тонком слое (неподвижной фазе), растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (подвижная фаза, элюент). При разделении вещества образуют на поверхности сорбента зоны адсорбции в виде пятен (круглых или эллипсовидных) или полос [3, 6].Для проведения тонкослойной хроматографии необходимо иметь следующие основные приборы и материалы:пластинки с закрепленным слоем сорбента (неподвижной фазы) различных модификаций;хроматографические камеры;калиброванные капилляры и микрошприцы;устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реагентов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хроматограмм в раствор и др.);стандартные образцы, растворители, реагенты для обнаружения хроматографических зон;облучатели с УФ-лампами на 254 и 365 нм;системы обработки и хранения данных [3, 5, 6].Качественной характеристикой в тонкослойной хроматографии является величина Rf (англ. ratio of fronts - отношение фронтов, или в иной трактовке retention factor - фактор удерживания), равная отношению расстояний, пройденных зоной вещества и фронтом растворителя (рисунок 1):Rf=l1l2, где l1 - расстояние от точки нанесения пробы до центра пятна, характеризующего зону адсорбции;l2 - расстояние от линии старта до линии фронта элюента.Рисунок 1 - Типовая хроматограмма в тонкослойной хроматографии: 1 – исследуемый образец, 2 – стандартный образецТаким образом величина Rf может находится в пределах от 0 до 1. Оптимальным для практической ТСХ является интервал изменения Rf от 0,2 до 0,8. При Rf = 0 вещество не движется, при Rf = 1 вещество не задерживается неподвижной фазой и движется с фронтом растворителя [6].Поскольку Rf зависит от условий опыта и может колебаться в некоторых пределах даже при использовании одной и той же хроматографической системы, для более достоверной идентификации веществ используют относительные величины Rf [3, 6]:Rfотн=Rfисследуемого веществаRfстандартного образца=lисследумого веществаlстандарного образцаПри разделении сложных смесей иногда используется двумерная хроматография, которая включает два этапа. После хроматографирования в первой системе пластинку высушивают и хроматографируют во второй системе, повернув на девяносто градусов таким образом, что линия, вдоль которой располагаются зоны разделившихся веществ, на этот раз служит линией старта. Если каждое из пятен вначале содержало несколько не разделившихся компонентов, они могут разделиться на втором этапе исследования (рисунок 2) [3, 6]. Рисунок 2 - Типовая хроматограмма в двумерной тонкослойной хроматографии: А - после хроматографирования в первой системе раствориелей, Б - после разворота пластинки и хроматографирования во второй системе растворителейВеличины Rf, полученные на первой и второй стадиях анализа, в сумме дают более полную информацию о веществах, чем при обычном (одномерном) хроматографировании.В настоящее время существует высокоэффективный вариант тонкослойной хроматографии - высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ). За счет меньшего размера частиц силикагеля (ТСХ - от 5 до 17 мкм, ВЭТСХ - от 2 до 5 мкм), пластинки для ВЭТСХ обеспечивают более высокие скорости разделений, лучшее разрешение и селективность чем обычные ТСХ пластинки [3, 5].Обнаружение (детектирование) зон адсорбции после проведения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:в видимом и ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны);опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;погружением в растворы обнаруживающих реагентов с использованием для этих целей специальных камер [1, 6].Количественное определение соединений может осуществляться непосредственно на хроматограмме либо после элюирования вещества с сорбента.На хроматограмме количественное содержание вещества определяют:планиметрически (по площади пятна)При планиметрии измеряют площадь пятна, например, с помощью миллиметровой кальки, и проводят расчет по предварительно построенному калибровочному графику (строится после хроматографировании серии разведение стандартного образца). Ошибка определения составляет 6 - 8% [1, 5, 6].денситометрически (по интенсивности окраски или оптической плотности пятна)Измерение оптической плотности пятна проводится с помощью прибора - денситометра, определяющего степень поглощения веществом отраженного или проходящего через хроматограмму света. Расчет содержания вещества в денситометрии проводится также с использованием калибровочного графика. Ошибка составляет 5 - 8% [1, 5, 6].Планиметрический метод является достаточно трудоемким, денситометрический требует специального оборудования, поэтому на практике они используются редко. Более удобным является хроматоспектрофотометрический метод - количественное определение, выполняемое после элюирования вещества, с использованием спектрофотометрии или другого общепринятого метода [1, 5, 6].Метод тонкослойной хроматографии получил широкое применение во многих отраслях промышленности (пищевой, фармацевтической, косметической и т.д.) для решения аналитических (разделение, идентификация и полуколичественная оценка содержания соединений в смеси) и препаративных задач (выделение и очистки индивидуальных соединений смеси) [1, 5, 6].Согласно ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография» в фармацевтическом анализе тонкослойная хроматография используется для установления подлинности (идентификации анализируемых веществ), определения содержание действующих веществ и посторонних примесей (испытания на чистоту) [3].В методиках нормативных документов указываются параметры хроматографирования:тип пластинки, используемый для хроматографирования (с указанием типа сорбента);подвижную фазу;методика приготовления испытуемых растворов;методика приготовления стандартного образца;методика приготовления реактивов для детектирования (при необходимости);методика проверки разделительной способности и пригодности хроматографической системы;методика элюирования и детектирования;референтные значения для сравнения полученных результатов [3, 4].Метод используется главным образом для анализа фармацевтических субстанций, но в виду ряда достоинств (высокая скорость разделения веществ, возможность использования разнообразных сорбентов и агрессивных реагентов-проявителей при повышенных температурах) применяется и для анализ лекарственных форм [1, 6].Стадии анализа методом тонкослойной хроматографииАнализ лекарственных форм методом тонкослойной хроматографии складывается из следующих стадий [3, 7]:Подготовительные работыПодготовить растворы испытуемого образца лекарственной формы и стандартного образца лекарственного вещества (пробоподготовка);Подготовить систему растворителей;Нанесение пробНанести капилляром или микрошприцем необходимые количества растворов испытуемого и стандартного образцов на стартовую линию хроматографической пластинки (на расстоянии примерно 15 мм от нижнего конца хроматографической пластины и по крайней мере 10 мм от вертикального края листа пластины), высушить пробы на воздухе.ЭлюированиеПоместить пластинку в камеру для хроматографирования;Хроматографировать в системе растворителей методом, указанным в нормативном документе (восходящий, нисходящий, круговой, горизонтальный);Вынуть хроматограмму из камеры по окончании хроматографирования, высушить на воздухе до удаления растворителей (рисунок 3);Рисунок 3 – Процесс хроматографированияОценка результатов (детектирование и документирование)Детектировать зоны на хроматограмме (обработать реактивом, просмотреть в УФ-свете при определенной длине волны и т.п.);Рассчитать значения Rf компонентов исследуемых и стандартных образцов;Сравнить полученные значения (исследуемых и стандартных образцов; исследуемых образцов и приведенные в нормативном документе);Сделать заключение о соответствии исследуемого образца требованиям нормативного документа по определяемому показателю. Применение тонкослойной хроматографии при анализе лекарственных формГосударственная фармакопея XIV издания регламентирует применять метод тонкослойной хроматографии для анализа (идентификации основного действующего вещества и/или родственных примесей) следующих лекарственных форм:Амоксициллин - порошок для приготовления суспензий для приема внутрь (ФС.3.1.0004.18), таблетки (ФС.3.1.0005.18);Ампициллина натрия - порошок для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения (ФС.3.1.0006.18);Ампициллин - таблетки (ФС.3.1.0007.18);Гамма-аминомасляная кислота - таблетки (ФС.3.3.0007.22);Гидрохлортиазид, таблетки (ФС.3.1.0018.18);Дексаметазон натрия фосфат - раствор для инъекций (ФС.3.1.0024.18);Диоксометилтетрагидропиримидин - мазь для местного и наружного применения (ФС.3.1.0025.18), суппозитории ректальные (ФС.3.1.0026.18), таблетки (ФС.3.1.0027.18);Ибупрофен - гель для наружного применения (ФС.3.1.0029.18), крем для наружного применения (ФС.3.1.0031.18), раствор для инъекций (ФС.3.1.0032.18), суспензия для приема внутрь (ФС.3.1.0034.18);Карбоцистеин - раствор для приёма внутрь (ФС.3.1.0152.22);Кетопрофен - аэрозоль для наружного применения (ФС.3.1.0042.18), гель для наружного применения (ФС.3.1.0043.18), крем для наружного применения (ФС.3.1.0046.18), раствор для инъекций и инфузий (ФС.3.1.0047.18);Кеторолака трометамол - капли глазные (ФС.3.1.0051.18), раствор для инъекций (ФС.3.1.0052.18), таблетки (ФС.3.1.0053.18);Лизиноприл - таблетки (ФС.3.1.0061.18);Мелоксикам - раствор для инъекций (ФС.3.1.0061.18), таблетки (ФС.3.1.0069.18);Никетамид - раствор для инъекций (ФС.3.1.0074.18);Стрептомицина сульфат - порошок для приготовления раствора для внутримышечного введения (ФС.3.1.0095.18);Тиамазол - таблетки (ФС.3.1.0096.18);Этилметилгидроксипиридина сукцинат - капсулы (ФС.3.1.0104.18);Бетаметазона дипропионат+Гентамицина сульфат - мазь для наружного применения (идентификация гентамицина, ФС.3.1.0120.22);Борная кислота+Метенамин+Натрия тетраборат+Салициловая кислота+Свинца ацетат+Тальк+Формальдегид+Цинка оксид, паста для наружного применения (идентификация метенамина, ФС.3.1.0121.22) [2, 4].Исследования по разработке новых методик анализа лекарственных форм методом ТСХ ведутся как отечественными, так и зарубежными научными и образовательными организациями.Например, сотрудниками Иркутского государственного медицинского университета предложено применять для разделения и идентификации компонентов лекарственного препарата «Но-шпалгин» ступенчатое хроматографирование на пластинках Сорбфил ПТСХ-АФ-В в двух системах растворителей (кислого и основного характера), содержащих в качестве главного компонента ацетон и хлороформ [8]. Примеры хроматограмм представлены на рисунке 4.АБРисунок 4 - Хроматограммы лекарственного препарата «Но-шпалгин» в системе ацетон-уксусная кислота ледяная 10:0,5 (А) и хлороформ-спирт этиловый 95%-аммиака раствор концентрированный 9:0,5:0,1 (Б): 1 - «Но-шпалгин», 2 - CО аскорбиновой кислоты, 3 - СО парацетамола, 4 - СО кодеина, 5 - СО дротаверина.На кафедре аналитической химии Института фармации Университета Каира изучают возможность применения тонкослойной хроматографии в сочетании с денситометрией (хроматоденситометрии) для идентификации и количественного определения амлодипина бесилата и валсартана в различных объектах, в том числе и в готовых лекарственных препаратах (рисунок 5) [9].3286125282540Б020000Б14649451087790А020000АББААРисунок 5 – Хроматоденситограмма амлодипина (А) и валсартана (Б) в системе этилацетат – метанол – аммония гидроксид (55:45:5)Болгарскими учеными из Медицинского университета Софии совместно с коллегами из Медицинского университета Пловдив предложен хроматоденситометрический метод анализа лекарственных форм, содержащих эстрадиол [12].Центром исследования и разработки лаборатории клинической фармации Университета Дженбер в Индонезии разработан и валидирован хроматоденситометрический метод идентификации и оценки количественного содержания гликлазида в твердых лекарственных формах [10]. Полученная денситограмма приведена на рисунке 6.Рисунок 6 – Денситограмма гликлазида в системе толуол – этилацетат (1:1)Способ определения метронидазола и родственных примесей в лекарственных формах предложен преподавателями кафедры фармацевтической химии Медицинского университета Софии [11].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:

Таким образом, на основании проведенного анализа литературы можно сделать вывод, что тонкослойная хроматография - это метод планарной хроматографии, в котором подвижной фазой является полярный или неполярный растворитель, или их смесь в различных соотношения, движущиеся через тонкий слой сорбента, нанесенный на инертную твердую подложку (пластинку). Разделение компонентов осуществляется по адсорбционному, распределительному, ионообменному механизмам или какой-либо их комбинации.В фармацевтическом анализе тонкослойная хроматография используется для установления подлинности, определения содержание действующих веществ, посторонних примесей в субстанциях и лекарственных препаратах.Отмечено, что в практике фармакопейного анализа лекарственных форм в Российской Федерации метод ТСХ в основном применятся только для идентификации действующих веществ и родственных примесей, когда как за рубежом предлагают преимущественно применять хроматоденситомтерический метод, позволяющий совместно проводить и качественный и количественный/полуколичественный анализ лекарственного препарата.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Георгиянц, В. А. Фармацевтический анализ: учеб. пособие для студ. вузов / П. А. Безуглый, В. А. Георгиянц, И. С. Гриценко [и др.]; под общ. ред. В. А. Георгиянц. — X.: НФаУ; Оригинал, 2016. - 541 с.Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания // Министерство здравоохранения Российской Федерации [сайт]. – https://minzdrav.gov.ru/ministry/61/10/gosudarstvennaya-farmakopeya-rossiyskoy-federatsii-xiv-izdaniyaГосударственная фармакопея Российской Федерации ΧIV издания. Том 2 // Федеральная электронная медицинская библиотека: [сайт]. – 2018. – URL : https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v14/vol2/pharmacopia/14_2/HTML/index.htmlГосударственная фармакопея Российской Федерации ΧIV издания. Том 3 // Федеральная электронная медицинская библиотека: [сайт]. – 2018. – URL : https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v14/vol3/pharmacopia/14_3/HTML/index.htmlИнструментальная тонкослойная хроматография: каталог CAMAG. – 48 с.Отто, М. Современные методы аналитической химии / М. Отто; пер. с нем. под ред. А. В. Гармаша. - 3-е изд. - Москва : Техносфера, 2008. - 543 с.Саушкина А. С. Стандартные операционные процедуры методик фармацевтического анализа: учебное пособие / А. С. Саушкина. — 3 изд., испр. и доп. — Санкт-Петербург: Лань, 2019. - 132 с.Тыжигирова, В. В. Анализ лекарственных препаратов Дротаверина гидрохлорида методом тонкослойной хроматографии / В. В. Тыжигирова, А. В. Усольцева // Инновационные технологии в фармации : Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора В.А. Маняка, Иркутск, 13 июня 2017 года / Под общей редакцией Е.Г. Горячкиной. – Иркутск: Иркутский государственный медицинский университет, 2017. – С. 105-111.Nesrin, K. R. Rapid and Highly Sensitive HPLC and TLC Methods for Quantitation of Amlodipine Besilate and Valsartan in Bulk Powder and in Pharmaceutical Dosage Forms and in Human Plasma / K. R. Nesrin, M. M. Heba, A. M. Azza // Analytical Letters. – 2010. – Vol. 43, No. 4. – pp. 570-581.Retnaningtyas, Y. Development and validation of TLC densitometry method for the determination of Gliclazide in tablet dosage form / Y. Retnaningtyas, L. Wulandari, F. Erliana // International Current Pharmaceutical Journal. – 2012 – Vol.1, No. 10. – pp. 332–335.Stamova, S. Development of a rapid and reproducible TLC method for purity elucidation and related substance identification of metronidazole in metronidazole dosage forms / S. Stamova, S. Georgieva, M. Georgieva // Scripta Scientifica Pharmaceutica. – 2020. – Vol.7, No. 2. – pp. 14-17.Tsvetkova, D. D. Application of TLC-Densitometry for Analysis of Estradiol Hemihydrate in Dosage Forms / D. D. Tsvetkova, D. P. Obreshkova, S. A. Ivanova, P. Y. Atanasov // Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research. – 2016. – Vol. 50, No. 3. – pp. 482-488.