Эссе на тему: "Внеклеточные ДНК: мусор, патоген или мишень для терапии"

Постановка проблемы.
О способности высвобождать генетический материал во внеклеточную
среду сообщалось в культурах многих видов бактерий, архей и грибов, а
также в контексте многоклеточных микробных сообществ, таких как
биопленки. Более того, внеклеточная ДНК микробного происхождения
широко распространена в естественной водной и наземной среде. В
высвобождении внеклеточной ДНК участвуют различные специфические
механизмы, такие как автолиз и активная секреция, а также через ее
ассоциацию с мембранными везикулами. Примечательно, что у
микроорганизмов, у которых высвобождение ДНК было подробно изучено,
выработка ДНК координируется популяцией, когда она достигает
определенной плотности клеток, и индуцируется в субпопуляции в ответ на
накопление сигналов распознавания кворума. Интересно, что у некоторых
бактерий также существует взаимосвязь между высвобождением вкДНК и
развитием естественной компетентности (способности поглощать ДНК из
окружающей среды), которая также контролируется кворумом. Тогда какова
биологическая функция вкДНК? Общая биологическая роль не предлагалась,
поскольку сообщалось о различных функциях в зависимости от
микроорганизма. Однако она, по-видимому, важна для образования
биопленок, может использоваться в качестве источника питательных веществ
и может участвовать в репарации повреждений ДНК и переносе генов.
В отличие от внутриклеточной ДНК, которая представляет собой ДНК,
расположенную внутри клеточных мембран, внеклеточная ДНК представляет
собой ДНК, расположенную за ее пределами. Такую ДНК можно найти в
любых образцах окружающей среды. Внеклеточная ДНК происходит из
внутриклеточной ДНК в результате активных или пассивных механизмов
экструзии или лизиса клеток.

В отношении ДНК окружающей среды используются несколько
сокращений для обозначения похожих или разных элементов. Хотя обычным
акронимом экологической ДНК является вкДНК, ряд авторов также
использовали этот акроним для внеклеточной ДНК. Кроме того, термины
exDNA или cfDNA (внеклеточная ДНК) были введены для обозначения
внеклеточной ДНК, чтобы предотвратить путаницу с ДНК окружающей
среды. Аббревиатуры esDNA, aDNA и cirDNA обозначают внеклеточную
собственную ДНК, древнюю ДНК и циркулирующую ДНК, соответственно,
и будут рассмотрены в главах «почва», «морские и озерные экосистемы» и
«человеческое тело» соответственно.
Цель работы заключается в исследовании сущности и значения
внеклеточных ДНК.
Основное изложение работы.
ДНК - это полимерная макромолекула, иммунологическая активность
которой может влиять как на нормальный, так и на аберрантный иммунитет.
В контексте иммунитета ДНК демонстрирует три характеристики, важные
для ее функции: структуру скелета, последовательность оснований и
межмолекулярное взаимодействие. В зависимости от взаимодействия этих
элементов ДНК может быть по существу инертной, с одной стороны, или
сильно активной, с другой. Помимо того, что сама по себе вызывает реакции,
ДНК может связывать другие молекулы с образованием комплексов,
активность которых превышает активность отдельных компонентов, и
создавать уникальные «опасные» сигналы. Опасность означает повреждение
организма, вызывающее иммунный ответ. [4]
Некодирующая ДНК (мусорная ДНК) (— части геномной ДНК
организмов, которые не кодируют последовательности белков. Некоторые
некодирующие ДНК переводятся в функциональные некодирующие РНК-
молекулы. Другие функции некодирующей ДНК включают регуляцию
последовательностей кодирующих белки, центромер и теломер. Термин
«мусорная ДНК» стал популярным в 1960-х. В соответствии с T. Ryan

Gregory, геномным биологом, первое явное обсуждение природы «мусорной»
ДНК было сделано David Comings в 1972 году и он применил этот термин ко
всем некодирующим ДНК. Термин был формализован Сусуму Оно в 1972
году[4], который заметил, что генетический груз нейтральных мутаций
находится на верхнем пределе значений для функционирующих локусов,
которые могли быть ожидаемыми исходя из типичной частоты мутаций.
Сусуму предсказал, что геномы млекопитающих не могут содержать более
чем 30 000 локусов из-за давления естественного отбора, так как «стоимость»
мутационной нагрузки вызвала бы неизбежное снижение
приспособленности, и в конечном счете вымирание. Этот прогноз остается
верным, геном человека содержит приблизительно 20 000 генов. Другим
подтверждением теории Оно служит наблюдение, что даже
близкородственные виды могут иметь очень разные (отличающиеся на
порядок) по размеру геномы, которое окрестили C-парадокс (избыточность
генома) в 1971 году.[5]
Первый элемент структуры внеклеточной ДНК - это позвоночник. ДНК
может иметь спиральную структуру, в которой две цепи переплетаются,
образуя левостороннюю двойную спираль, которая является очень прочной и
стабильной. Второй элемент структуры - это последовательность оснований,
которая передает информацию для кодирования белков и регуляции генов.
Последовательность сильно варьирует среди видов и, кроме того,
подвергается эпигенетической модификации реакциями метилирования
оснований, которые могут изменять взаимодействие ДНК с белками. [1]
Третий элемент структуры ДНК, важный для иммунитета, касается
связывания с белками. В хроматине внутри ядра клетки ДНК обернута
вокруг гистонового ядра, состоящего из двух копий гистона H2A, H2B, H3 и
H4 каждая; ДНК между нуклеосомами называется линкерной ДНК. Однако
структура хроматина не статична, и другие белки могут связывать ДНК,
включая межнуклеосомные участки. Среди этих белков гистон H1 и HMGB1,
негистоновый ядерный белок, в большом количестве встречаются в ядре и

имеют более временное и менее стабильное связывание с ДНК, чем ядерные
гистоны ядра. По своей природе ДНК предназначена для взаимодействия с
белками, и экспонирование ДНК в свободной или «голой» форме во
внутриклеточном или внеклеточном пространстве в лучшем случае может
быть ограничено. [7]
Поскольку внеклеточная ДНК является источником генетической
информации, неповрежденная структура важна для выживания и деления
клеток, что обеспечивается системами, распознающими и
восстанавливающими повреждения ДНК. Тем не менее, как часть апоптоза,
формы запрограммированной гибели клеток, ДНК подвергается обширному
перевариванию, опосредованному клеточными ДНК. Эти реакции могут
расщеплять ДНК с образованием ДНК с более низким молекулярным весом,
включая «лестницы», в которых ДНК существует в количестве, кратном
обычной длине ДНК, которая окружает основные гистоны. Функция реакций
расщепления во время апоптоза неизвестна, хотя они могут представлять
собой защитную систему для разрушения и инактивации ДНК от
заражающих организмов, таких как вирусы. Расщепление ДНК может также
облегчить фагоцитарную очистку дебриса от апоптотических клеток; любая
ДНК, которая ускользает от фагоцитарной очистки, может элиминировать
нуклеазы крови и связывающие белки. Интересно, что дефекты
внутриклеточных и внеклеточных нуклеаз могут предрасполагать к
аутоиммунитету, предположительно за счет увеличения количества
иммуноактивной ДНК в системе. [2]
Принимая во внимание структуру ДНК и ее существование в форме
нуклеосом, анализ внеклеточной ДНК может быть выполнен с помощью
биохимических или молекулярных анализов самой ДНК или анализа
нуклеосом в крови; в этих анализах используют сыворотку или плазму, из
которой клеточные элементы, включая тромбоциты, удаляются
дифференциальным центрифугированием для получения бесклеточного
препарата.

Кровь является богатым источником внеклеточных нуклеиновых
кислот, которые составляют то, что можно назвать нуклеомом крови по
аналогии с протеомом и транскриптомом. ДНК является основным
компонентом нуклеома, и хотя РНК также присутствует, РНК более лабильна
и подвержена расщеплению нуклеазами, чем ДНК. Помимо ДНК и РНК,
нуклеом крови содержит ядерные белки, включая гистоны и HMGB1. Как
теперь известно, цитокины, такие как IL-1α и IL-33, также происходят из
ядра клетки и могут быть отнесены к этой рубрике. Даже у нормальных
людей кровь содержит значительные концентрации ДНК, вероятно, из-за
большого количества клеток, которые умирают каждый день. [3]
Молекулы ДНК не находятся исключительно в клетках, но являются
важным компонентом внеклеточной среды. Внеклеточная ДНК давно
известна как одна из самых распространенных молекул в слизистых
биологических матрицах, образованных различными микроорганизмами,
такими как галофилы. Впоследствии она была обнаружена в супернатанте
жидких культур многих видов бактерий. Более того, было выявлено, что
вкДНК является важным компонентом внеклеточного матрикса
многоклеточных сообществ, таких как биопленки, образованные бактериями,
археями и грибами.
Более того, явление высвобождения вкДНК наблюдается не только в
лабораторных условиях, но и в естественной среде, и ее можно найти в
большинстве проб из водных и наземных экосистем, колонизированных
микроорганизмами. В этих экосистемах вкДНК может частично возникать в
результате лизиса микробных клеток из-за литических фагов или некроза,
или в результате специфических механизмов, которые были описаны у
культивируемых микроорганизмов, как обобщено ниже, таких как автолиз и
системы активной секреции, а также через его связь с внеклеточными
мембранными везикулами.
Термин ДНК окружающей среды, который в литературе также
сокращается как вкДНК, не следует путать с внеклеточной ДНК.

Экологическая ДНК относится к общей ДНК, которая может быть извлечена
из образца окружающей среды, который представляет собой сложную смесь
клеточной геномной ДНК живых организмов и внеклеточной ДНК. [6]
Микроорганизмы используют межклеточную коммуникацию внутри
больших групп клеток для координации различных процессов, таких как
биолюминесценция, выработка антибиотиков, споруляция, компетентность,
роение подвижности и образование биопленок и плодовых тел. Таким
образом, отдельная клетка активирует определенные функции, обнаруживая
наличие критической плотности популяции, и все сообщество ведет себя как
многоклеточный организм.
Интересно, что большинство известных механизмов высвобождения
вкДНКрегулируются с помощью кворума (QS): системы связи, зависящей от
плотности клеток, которая регулирует кооперативное поведение.
Следовательно, вкДНК обычно продуцируется в ответ на увеличение
плотности клеток в популяции. Кроме того, следует отметить, что у
некоторых бактерий пути высвобождения вкДНК связаны с развитием
естественной компетентности, которая позволяет трансформировать клетки
ДНК. [7]
Внеклеточная ДНК широко распространена в окружающей среде. Она
была обнаружена в широком диапазоне сред, таких как морские и
пресноводные экосистемы, отложения, почвы и биопленки, и было показано,
что она получена из бактерий, архей, эукариот и вирусов. Таким образом,
присутствие внеклеточной ДНК широко распространено, что делает ее более
важным и распространенным явлением, чем считалось ранее. Хотя вкДНК в
окружающей среде теперь лучше охарактеризована, необходимы дальнейшие
исследования, чтобы понять ее роль в поддержании экосистемы и, в более
широком смысле, в эволюции.
В морских, океанических и пресноводных экосистемах термин
«растворенная ДНК» обычно используется для обозначения всего количества
ДНК, которое может быть извлечено из проб воды. Сообщалось о

концентрациях вкДНК в диапазоне от 0,03 до 88 мкг / л, в широком
диапазоне в результате физико-химических, экологических и географических
разниц. [2]
В морской среде минимальная концентрация ДНК составляет <1 мкг / л
в олиготрофных океанах, в то время как она может достигать максимума 44
мкг / л в субтропических эстуариях. В общем, концентрация вкДНК
уменьшается с увеличением расстояния до берега и с глубиной.
Интересно, что вкДНК может быть включена в другие бактерии.
Внеклеточная ДНК может играть разные роли в экосистеме, например, она
является частью большинства растворенных органических веществ в
морских экосистемах.
Глубоководные морские отложения являются крупнейшим
резервуаром ДНК в мировом океане, в общей сложности 0,50 ± 0,22 Гт ДНК
на поверхности 10 см.
Что касается вкДНК в почвах, отчеты различаются в зависимости от
типа образца. Внеклеточная ДНК очень стабильна как в отложениях, так и в
почве, благодаря чему сохраняется в течение длительного времени.
Считается, что источниками возникновения вкДНК в крови являются
процессы гибели клеток, созревание эритроцитов, секреция ДНК клетками, а
также бактерии и вирусы. Сразу отметим, что последний источник, ДНК
бактерий и вирусов, вносят очень незначительный вклад в общий пул
циркулирующей ДНК, и уровень экзогенной ДНК во время инфекций не
превышает нескольких десятков пкг/мл. Тогда как по современным данным
нормальный уровень вкДНК в здоровом организме составляет 3-44 нг/мл в
плазме и 50-100 нг/мл в сыворотке крови.
Значительная часть вкДНК в организме, вероятно, появляется в
результате гибели клеток, в процессе апоптоза, некроза и нетоза. Ежедневно
в организме взрослого человека посредством программируемой клеточной
гибели (апоптоза) гибнет около ста миллиардов клеток, в результате чего
деградирует около 1г ДНК в сутки. [2]

В процессе апоптоза ядерная ДНК расщепляется специальным
ферментом ДНКазой. После чего появляются фрагменты ДНК длиной
кратной нуклеосоме (180-200 п.н., п.н. — пар нуклеотидов), которые в
составе апоптотических телец (специальной упаковки после апоптоза)
должны быть утилизированы макрофагами. Все знают, что пары нуклеотидов
(аденин-тимин и гуанин-цитозин) в нашей ДНК повторяются три миллиарда
раз. Нуклеосомы — специальные структуры в составе хроматина, состоящие
из белков-гистонов, на которые в полтора оборота наматывается нить ДНК.
Дальше происходит странное. По непонятным причинам часть ДНК
погибших клеток избегает встречи с макрофагами и попадает в кровь. В
разное время проводились эксперименты, подтверждавшие апоптотическую
природу вкДНК [1].
При разделении вкДНК плазмы здоровых доноров с помощью гель-
электрофореза обнаруживаются полосы, соответствующие длинам
фрагментов 180-200 п.н. и длинам, кратным этому числу, что соответствует
межнуклеосомному расщеплению хроматина при апоптозе. Обнаружение
ДНК плода в крови матери также говорит в пользу апоптоза как источника
вкДНК [3].
В норме некроз вносит менее значительный вклад в появление вкДНК,
увеличивая её количество при тяжёлых травмах. Некротическая вкДНК в
плазме обнаруживается в виде более длинных фрагментов — длиной свыше
10 тысяч п.н. С помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции)
возможно различить длинные фрагменты вкДНК, появляющиеся в результате
некроза, и более короткие фрагменты — из-за апоптоза.
Кроме апоптоза и некроза существует ещё один малоизвестный вид
клеточной гибели, являющийся источником вкДНК — нетоз (NETosis).
При нетозе клетки-нейтрофилы выбрасывают специальные
сетеподобные структуры, внеклеточные нейтрофильные ловушки (NET,
Neutrophil Extracellular Trap), задача которых — дезактивация проникшего в
организм патогена: вирусов, грибов и бактерий. При этом нейтрофил гибнет,

выбрасывая ДНК, гистоны, различные белки и ферменты во внеклеточное
пространство. Известно, что иногда процесс NET носит патологический
характер, способствуя развитию тромбоза, сердечно-сосудистых и
аутоиммунных заболеваний, а также рака.
Недавно, в 2018 году, было обнаружено, что при ВИЧ-инфекции
происходит гиперактивация нейтрофилов, механизма NET и нетоза. В
результате чего происходила обширная гибель иммунных клеток,
захваченных сетями нейтрофилов, CD4+ и CD8 + Т-клеток, В-клеток и
моноцитов, и развитие сопутствующих сердечно-сосудистых патологий [4].
Ещё один потенциальный источник вкДНК — секреция ДНК
нормальными и опухолевыми клетками. Ещё в 1972 году было получено
доказательство активного выделения ДНК лимфоцитами во внеклеточную
среду [5].
Наличие такое феномена, как выделение ДНК клетками во
внеклеточную среду, предполагает существование специальных механизмов
переноса ДНК через клеточную мембрану. В ходе исследований было
установлено, что высвобождение ДНК из лимфоцитов происходит при
активном действии трипсина, проназы и плазмина на фоне дефицита ионов
Са2+ и Mg2+. Избыток же ионов кальция ингибирует выход ДНК из клетки
[6].
Выводы. Подытоживая вышесказанное, отметим, что По мнению
российских биохимиков из Казанского государственного университета, ещё
одним вероятным источником вкДНК в крови может быть совсем
неизвестная форма цитоплазматической ДНК, отличная от ядерной и
митохондриальной — ДНК, ассоциированная с мембраной диплоидных
лимфоцитов человека [7].
Какая-то часть вкДНК может формироваться из этой
цитоплазматической ДНК, на что указывают характерные особенности
некоторых фрагментов вкДНК, отличные от ядерной и митохондриальной.

Несмотря на то, что этот тип ДНК был открыт в 1971 году, он и сейчас
остаётся неизученным.

Библиографический список

1. Баранов В. С., Кузнецова Т. В., Кащеева Т. К., Иващенко Т. Э.
Пренатальная диагностика наследственных болезней: состояние и
перспективы. 2-е изд. СПб.: Эко-Вектор, 2017. 471 с.
2. Внеклеточная ДНК: история в пяти вопросах. //
https://tass.ru/sci/6821419#:~:text=Внеклеточная%20ДНК%20—%20естеств
енный%20компонент%20плазмы,состояний%20количество%20вкДНК
%20резко%20вырастает.
3. Воронин С. В., Кику П. Ф., Ярыгина М. В. Оптимизация пренатальной
диагностики врожденных пророков развития у населения Приморского
края // Здравоохранение Рос. Федерации. 2016. Т. 60, № 6. С. 332-335.
4. Емельяненко Е. С. Концепция пренатальной диагностики //
Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2019. Т. 7, № 3.
С. 14-20.
5. Жигалина Д. И., Скрябин Н. А., Лебедев И. Н. Неинвазивная ДНК-
диагностика в репродуктивной медицине // Мед. генетика. 2015. Т. 10.
С. 3-13.
6. Малышева О. В., Баранов В. С. Неинвазивная пренатальная
диагностика. Проблемы, подходы и перспективы // Журналъ
акушерства и женскихъ болезней. 2012. Т. LXI, № 3. С. 83-93.
7. Чернов А.Н., Глотов О.С., Донников М.Ю., Коваленко Л.В.,
Белоцерковцева Л.Д., Глотов А.С. ПРЕНАТАЛЬНАЯ
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА: ПРИНЦИПЫ, МЕТОДЫ,
ПРИМЕНЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ. Вестник СурГУ. Медицина. 2020;
(2). – С. 54-65.