Аскорбиновая кислота: структура, свойства, методы получения

Введение

Данная курсовая работа посвящена изучению строения, структуры, физических и химических свойств и методам получения органического вещества – аскорбиновой кислоты.
Для реализации поставленных целей была изучена теоретическая информация, касающаяся свойств и методов получения вещества, изучены особенности инструментальных методов анализа, особенности качественных реакций по определению аскорбиновой кислоты, значимости кислоты в биохимических реакциях, выбрана методика получения и определения аскорбиновой кислоты с целью получения опыта проведения исследований веществ с использованием инструментальных методов анализа, практического освоения полученных знаний по свойствам и особенностям вещества.
Теоретическая часть1 Характеристика вещества1.1 Структура веществаСтруктурная формула аскорбиновой кислоты:
Брутто-формула С6Н8О6
Из-за наличия двух асимметрических атомов существуют четыре диастереомера аскорбиновой кислоты. Две условно именуемые L- и D- формы хиральны относительно атома углерода в фурановом кольце, а изо- форма является D-изомером по атому углерода в боковой этиловой цепи [1].
Оптические изомеры аскорбиновой кислоты: 1а-L-аскорбиновая кислота; 2а-L-изоаскорбиновая кислота; 1б-D-изоаскорбиновая кислота; 2б-D-аскорбиновая кислота [1]:
238696522898112б
002б
65341422898102а
002а
238696511372851б
001б
58674010706111а
001а

Аскорбиновая кислота по своему строению может быть отнесена к производным углеводов. Она представляет собой- 2,3- дидегидротрео-гексоно-1,4-лактон. Благодаря наличию двух асимметрических атомов углерода в положениях 4 и 5 аскорбиновая кислота образует четыре оптических изомера и два рацемата. Оптические изомеры: D- и L- аскорбиновые кислоты и их диастереоизомеры - D- и L-изоаскорбиновые кислоты. Природная биологически активная аскорбиновая кислота имеет L-конфигурацию. D-аскорбиновая и L- и D-изоаскорбиновые кислоты в природе не встречаются и получены только синтетическим путем [1].
1.2 Физические и химические свойства аскорбиновой кислотыАскорбиновая кислота (от др.-греч. ἀ «не-» + лат. scorbutus «цинга») — первоначально называлась гексуроновая кислота- белый кристаллический порошок кислого вкуса. Легко растворим в воде (1: 3,5), медленно растворим в этаноле (1:30), абсолютном спирте (1:50), глицерине (1:100), пропиленгликоле (1:20). Растворимость в спиртах зависит от числа атомов углерода в их молекуле: хорошо в метаноле, труднее в этаноле, в амиловом спирте-трудно. Растворимость в воде: 80,0% при 100 °C; 40,0% при 45 °C. Практически нерастворим в эфире, бензоле, хлороформе, петролейном эфире, маслах, жирах. Под воздействием воздуха и света постепенно темнеет. В сухом виде стабилен на воздухе, водные растворы на воздухе быстро окисляются. Молекулярная масса 176,13 [2].
Кислота аскорбиновая – одноосновная кислота. Кислотный характер обусловлен водородом в OH-группе в 3 положении [3].

220599061595Аскорбинат натрия
00Аскорбинат натрия

Легко окисляется благодаря наличию ендиольной группировки, что обуславливает ее химические свойства и физиологические активы [3].

Благодаря подвижности H+, аскорбиновая кислота легко окисляется в две стадии:
Обратимое окисление до дегидроаскорбиновой кислоты [3,4]:
4533901104900Енольная форма
0Енольная форма

240601540640Кетонная форма
дегидроаскорбиновой кислоты
0Кетонная форма
дегидроаскорбиновой кислоты

В водной среде процесс идет дальше до разложения дегидроаскорбиновой кислоты.
Все реакции подлинности основаны на восстановительных свойствах аскорбиновой кислоты.
С раствором нитрата серебра образуется темно-серый осадок свободного серебра [3,4,5,6]:
4253865330835224790-25400
При прибавлении к раствору препарата раствора 2,6 – дихлорфенолиндофенола синяя окраска последнего исчезает [3,4,5]:
44062651176020лейкооснование
(бесцветное)
00лейкооснование
(бесцветное)
119634011950702,6-дихлорфенолиндофенол
(хиноидная структура)
002,6-дихлорфенолиндофенол
(хиноидная структура)

С реактивом Фелинга:

С раствором йода (обесцвечивание):

 С раствором перманганата калия:

С феррицианидом калия в присутствии соляной кислоты и хлорида железа (III) → образуется берлинская лазурь синего цвета [3]:

 В водных растворах аскорбиновая кислота дает кислую реакцию (для 0,1 н. раствора рН 2,2) и обычно реагирует как одноосновная кислота. Лактоны нейтральны, и потому кислые свойства аскорбиновой кислоты обусловлены главным образом гидроксилъной группой в положении 3. Частично за кислую реакцию ответственна гидроксильная группа в положении 2. Константа диссоциации составляет pK1=4,17 и рК2=11,57. Двойная связь способствует стабилизации лактонного кольца. Ненасыщенное γ-лактоновое кольцо аскорбиновой кислоты подвергается гидролизу лишь при действии сильных щелочей; при этом она превращается в соответствующую кетокислоту. Со слабыми щелочами аскорбиновая кислота образует нейтральные монощелочные еноляты без размыкания лактонного кольца [3,4,5].
Наличие в аскорбиновой кислоте двух сопряженных двойных связей обусловливает ее способность к обратимому окислению, продуктом которого является дегидроаскорбиновая кислота (далее- ДАК). Она представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 220-225°, хорошо растворимые в воде. ДАК очень устойчива. Когда в структуре разрывается лактонная связь, она превращается в 2,3-дикето-L-гулоновую кислоту. Эта реакция необратима. При окислении дикетогулоновая кислота расщепляется на щавелевую и L-треоновую кислоты [6].
Вследствие легкой окисляемости аскорбиновая кислота является донором водорода, количественно восстанавливает многие соединения. Такие окислительно-восстановительные реакции положены в основу многих методов определения аскорбиновой кислоты [6,7].
Из других свойств аскорбиновой кислоты следует отметить ее способность к образованию простых и сложных эфиров. Наиболее известен пальмитат аскорбиновой кислоты, который используют для витаминизации пищевых продуктов [4,5,6]:

1.3 Биохимические функцииВитамин С занимает доминирующее положение в антиоксидантной защите. Антиоксидантная функция аскорбиновой кислоты объясняется ее способностью легко отдавать два атома водорода, используемых в реакциях обезвреживания свободных радикалов. В высоких концентрациях этот витамин «гасит» свободные радикалы кислорода. Важной функцией аскорбата является обезвреживание свободного радикала токоферола (витамина Е), благодаря чему предупреждается окислительная деструкция этого главного антиоксиданта клеточных мембран. Как антиоксидант аскорбиновая кислота необходима для образования активных форм фолиевой кислоты, защиты железа гемоглобина и оксигемоглобина от окисления, поддержания железа цитохромов Р450 в восстановленном состоянии [7].
Витамин С участвует в процессе всасывания железа из кишечника и высвобождении железа из комплекса с его транспортным белком крови – трансферрином, облегчая поступление этого металла в ткани. Аскорбиновая кислота может включаться в работу дыхательной цепи митохондрий, являясь донором электронов для цитохрома С.
Благодаря способности легко окисляться и восстанавливаться, аскорбиновая кислота участвует в реакциях гидроксилирования остатков лизина и пролина при синтезе коллагена (основного белка соединительной ткани).
Витамин С активно участвует в обезвреживании токсинов, анти-биотиков и других чужеродных для организма соединений, осуществляемых монооксигеназной системой цитохромов Р450 [7,8].
Необходимо подчеркнуть, что выраженный антиоксидантный эффект аскорбата проявляется только при совместном его введении с токоферолом, поскольку именно витамин Е способен эффективно обезвреживать свободные радикалы жирных кислот и их перекиси. Таким образом, аскорбиновая кислота стабилизирует витамин Е, который легко разрушается, а витамин Е усиливает антиоксидантное действие витамина С. Помимо токоферола синергистом действия аскорбата является витамин А.
Витамин С является антиканцерогеном не только в силу его антиоксидантных свойств, но и в силу способности непосредственно предотвращать нитрозаминовый канцерогенез (эти сильные канцерогены образуются в кислой среде желудка из нитритов и аминосоединений пищи). Однако аскорбат не защищает от влияния уже образовавшихся нитрозаминов, поэтому консервированные мясные продукты необходимо употреблять с овощами и зеленью, богатыми витамином С [7,8].
Суточная потребность человека в витамине С зависит от ряда причин: возраста, пола, выполняемой работы, климатических условий, вредных привычек: болезни, стрессы, лихорадка и подверженность токсическим воздействиям (таким, как сигаретный дым) увеличивают потребность в витамине С; в условиях жаркого климата и на Крайнем Севере потребность в витамине С повышается на 30-50 процентов; молодой организм лучше усваивает витамин С, чем пожилой, поэтому у лиц пожилого возраста потребность в витамине С несколько повышается [8,9].
Витамин С не способен накапливаться в организме, и все избыточное количество, поступившее с пищей или витаминными добавками, выводится из организма в течение короткого промежутка времени.
Средневзвешенная норма физиологических потребностей составляет 60-100 мг в день. Обычная терапевтическая доза составляет 500-1500 мг ежедневно [6,8,9].
Источниками витамина С среди пищевых продуктов являются: сезонная ягода, капуста, цитрусовые, киви, помидоры, картофель, болгарский перец, листья салата, щавеля, шпината и другие. Плоды шиповника, облепихи, витамин С содержит также в лекарственных растениях: листьях крапивы, цветки ромашки, одуванчика, мята, мелисса, душица, почки сосны, цветки бессмертника.
1.4 История открытия, значение и применение аскорбиновой кислотыВ 1928 году американский биохимик Альберт Сент-Дьёрди (1893 – 1986 гг.) впервые выделил из растительных тканей гексуроновую кислоту в чистом виде и доказал, что она идентична витамину С. В 1937 году за это открытие ученый удостоился Нобелевской премии. В 1932 году научный сотрудник Питсбургского университета Чарльз Глен Кинг (1896 – 1988 гг.), проводя опыты с гексуроновой кислотой, установил связь между нехваткой витамина С и развитием цинги. В честь этого открытия Сент-Дьёрди переименовал кислоту в аскорбиновую – ascorbic acid. Слово «ascorbic» образовано от латинского «scorbutus», что значит цинга. Симптомы цинги были описаны еще в египетских папирусах, датированных 1550 годом до н.э. Но формат эпидемии это заболевание приобрело в период эпохи Великих географических открытий. По статистике с 1500 по 1800 гг. от этой болезни умерло два миллиона моряков. Долгое время цинга считалась инфекционным заболеванием. Лишь в 1747 году Джеймс Линд (1716 – 1794 гг.), врач морского госпиталя, доказал, что фрукты и зелень могут препятствовать развитию этого недуга. В 1753 году он опубликовал свой труд «Трактат о цинге», в котором указывал, что болезнь может быть успешно излечена на примере группы монахинь, поправившихся после введения в их рацион сока лайма. Научное общество встретило эту работу с недоверием, хотя морякам подобный способ лечения и профилактики цинги пришелся по вкусу. Так капитан Джеймс Кук (1728 – 1779 гг.) во время своего второго кругосветного путешествия (1772 – 1775 гг.) ввел в рацион питания на корабле фрукты, поэтому ни один из членов его экипажа не умер от цинги. С открытием целебных свойств витамина С на него стали возлагать большие надежды в профилактике и лечении многих заболеваний – от простуды до рака. В 1970 году американский химик, обладатель двух Нобелевских премий, Лайнус Полинг (1901 – 1994 гг.) опубликовал статью «Эволюция и потребность в аскорбиновой кислоте», в которой изложил свою теорию о том, что употребление больших доз витамина С необходимо для поддержания здоровья организма. С помощью подобного метода ученый пытался вылечить свою жену, умиравшую от рака. К сожалению, Полинг не мог знать о том, что высокие дозы этого вещества способствуют устойчивости раковых опухолей при лучевой терапии, поэтому участь его супруги была предрешена. Сейчас продажа витамина С ограничена во многих странах Европы. Была запрещена реклама, использующая слова «продлевает», «лечит», «излечивает». Быть может, в недалеком будущем, витамин С будет отпускаться наравне с сильнодействующими лекарствами только по рецепту врача [10].
2 Методы получения аскорбиновой кислоты2.1 Промышленные способы получения
Промышленный способ получения аскорбиновой кислоты может быть основан на получении её из моносахаридов D- или L-ряда.
Известно несколько методов ее синтеза.
1. Бензоиновый метод: в основе лежит конденсация треозы и этилглиокислота в присутствии KCN. Метод неперспективен из-за дефицитности сырья, низкого выхода.
2. Циангидриновый метод: аскорбиновую кислоту получают, исходя из L-ликсозы или L-ксилозы. Практического применения не имеет из-за отсутствия сырья, синтез которого из D-глюкозы очень сложен.
3. Получение аскорбиновой кислоты из свекловичного «жома» (отходы производства сахара из свеклы). Метод предложен американцами в 1904 г. Метод нуждается в значительном усовершенствовании: из 100 кг жома получают всего 2,5 кг аскорбиновой кислоты.
4. Частично микробиологический метод получения аскорбиновой кислоты из D-глюкозы. Включает 5 стадий, в том числе 3стадии- химические. В основе метода лежит окисление D-глюкозы уксуснокислыми бактериями до кальциевой соли 5-кето-D-глюконовой кислоты, которую превращают в L-аскорбиновую кислоту. Метод привлекает внимание ограниченным применением химических реагентов. Однако выход продукта низок, а процессы микробиологического синтеза трудно управляемы.
5. Метод Рейхштейна: синтез L-аскорбиновой кислоты из 2-кето-L-гексоновой кислоты. Основное сырье (D-глюкоза) и вспомогательные реагенты, применяемые для синтеза, используются в пищевой и химической промышленности. Метод нашел применение во многих странах [11,12].
Метод Рейхштейна состоит из 6 стадий, включая стадию микробного синтеза.


Рисунок 1. Схема синтеза аскорбиновой кислоты по методу Рейхштейна [11,12]
D-Глюкозу гидрируют в D-сорбит и ферментативно (Acetobacter suboxydans) окисляют его в  L-сорбозу. Циклическую форму α -L-сорбофуранозы действием ацетона и серной кислоты превращают в диизопропилиденсорбозу. Ацетонирование сорбозы при низких температурах (–5 °С) дает существенное повышение выхода ди-О-изопропилиденового производного. Дальнейшее окисление диацетонсорбозы до кислоты обычно выполняется с помощью гипохлорита натрия в присутствии сульфата никеля. Изопропилиденовые защитные группировки снимают действием хлороводородной кислоты в безводной среде (этанол-хлороформ, 65 °С, 50 ч). Образующаяся циклическая форма переходит в 2-оксогулоновую кислоту, при действии на которую кислоты происходит лактонизация; промежуточно образующееся соединение затем енолизуется, давая аскорбиновую кислоту.
Сырой продукт выделяют, очищают активированным углем и перекристаллизовывают из воды. Обычно выход на каждой стадии превышает 90 %, выход конечного продукта в расчете на исходную глюкозу превышает 50 % [11,12].
Кислоту аскорбиновую можно выделить из растительного сырья, в частности из плодов шиповника, например. Вначале получают водные экстракты, сгущают их до сиропов в вакууме, осаждают сопутствующие вещества (спиртом или эфиром), а остаток очищают хроматографическими методами и перекристаллизовывают [13].
Синтез аскорбиновой кислоты—многостадийный процесс, требующий использования большого количества растворителей и различных видов сырья. Выбросы в атмосферу и образование значительного количества кислых стоков на стадии ацетонировання являются серьезным недостатком процесса в целом.
Наиболее совершенная стадия в промышленном синтезе аскорбиновой кислоты—трансформация D-сорбита в L-copбозу, осуществляемая микробиологическим окислением. При этом используется уникальное свойство бактерий — выполнять направленный процесс окисления многоатомных спиртов в сахаре.
В исследованиях, направленных на усовершенствование синтеза витамина С, четко прослеживается тенденция к сокращению числа химических стадий за счет привлечения биотехнологических методов. Используя микробиологический метод, можно осуществить в одном ферментере двухстадийный синтез 2-кето-1-гулоновой кислоты с высоким выходом—84,6% (при химическом синтезе 65—69%) [11,12].
2.2 Качественные реакции на аскорбиновую кислоту2.2.1 Инструментальные методы анализаИнфракрасная спектроскопия (ИК-спектроскопия или колебательная спектроскопия) — это измерение взаимодействия инфракрасного излучения с веществом путем поглощения, испускания или отражения. Он используется для изучения и идентификации химических веществ или функциональных групп в твердой, жидкой или газообразной форме. Метод или техника инфракрасной спектроскопии осуществляется с помощью прибора, называемого инфракрасным спектрометром (или спектрофотометром), который производит инфракрасный спектр. ИК-спектр можно визуализировать на графике поглощения инфракрасного света. (или коэффициент пропускания) по вертикальной оси в зависимости от частоты или длины волны по горизонтальной оси [14].
ИК- спектр аскорбиновой кислоты имеет вид с соответствующими строению полосами поглощения:

Рисунок 2. ИК-спектрограмма аскорбиновой кислоты [15]
2.2.2 Химические методыПервый метод основан на том, что 0,05 г субстанции растворяют в 2 мл воды и прибавляют 0,5 мл раствора серебра нитрата. Выпадает темный осадок металлического серебра.
Второй метод основан на том, что к 1 мл 5% раствора субстанции прибавляют 2 мл 0,1 М раствора йода. Реактив обесцвечивается.
В Международной фармакопее приведена следующая методика определения подлинности аскорбиновой кислоты: растворяют 0,04 г препарата в 4 мл воды, прибавляют 0,1 г гидрокарбоната натрия и около 20 мг сульфата железа (II); встряхивают и оставляют стоять; появляется темно-фиолетовой окрашивание, которое исчезает при добавлении 5 мл серной кислоты (≈100 г/л) [16].

Качественной реакцией на аскорбиновую кислоту также является реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия, синее окрашивание которого исчезает от действия на реактив аскорбиновой кислотой.
2.3 Определение количественного содержания аскорбиновой кислоты2.3.1 ЙодатометрияКоличественное определение аскорбиновой кислоты методом йодатометрии. Около 0,1 г (точная навеска) субстанции растворяют в 20 мл воды, прибавляют 0,5 мл 1% раствора калия йодида, 1 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты и титруют 0,0167 М раствором калия йодида до появления стойкого слабо-синего окрашивания (индикатор - 2 мл раствора крахмала) [16,17]:

Избыточная капля титрованного раствора калия йодата реагирует с калия йодидом, выделяя йод, который указывает на конец титрования. 0,0167 М раствора калия йодата соответствует 8,824 мг С6Н8О6.
2.3.2 Йодометрия
Точную навеску (около 0,2 г) препарата растворяют в смеси 25 мл воды, свободной от углекислоты и 25 мл серной кислоты (≈ 100 г/л). Титруют без остановки раствором йода (0,1 моль/л), используя в качестве индикатора раствор крахмала, прибавляемый к концу титрования. Титрование проводят до появления устойчивого синего окрашивания.
Каждый миллилитр раствора йода соответствует 8,806 мг С6Н8О6.

2.3.3 АлкалиметрияАскорбиновую кислоту определяют также методом нейтрализации, используя кислотные свойства ее растворов. Кислота аскорбиновая титруется стандартным 0,1 М раствором натрия гидроксида, как одноосновная кислота по енольному гидроксилу в 3-ем положении [16,17]:

2.3.4 Инструментальные методы определенияДля определения количественного содержания аскорбиновой кислоты применяются традиционные титриметрические методы. Несмотря на неоспоримые достоинства титриметрии, этот метод имеет ряд ограничений, к числу которых следует отнести: невозможность получения достоверного результата в присутствии других компонентов, входящих в состав лекарственного средства; высокая лабильность и способность к окислению. Поэтому все более широко применяются инструментальные методы анализа.
Современная высокоэффективная жидкостная хроматография (далее- ВЭЖХ) является одним из эффективных методов анализа и разделения сложных смесей. Высокоэффективная жидкостная хроматография – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой является жидкость, движущаяся через колонку, которая заполнена неподвижной фазой (сорбентом). Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование высокого давления и мелкозернистых сорбентов (3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа составляет от 3 до 30 мин) [18].
Ведутся исследования по применению метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Тонкослойная хроматография представляет собой планарную жидкостную хроматографию, в которой разделение смеси веществ осуществляется на открытом тонком слое сорбента или в пленках пористого полимерного материала.
Разработан способ определения процентного содержания аскорбиновой кислоты, заключающийся в измерении светового потока, прошедшего через раствор и рассеянного раствором аскорбиновой кислоты, при этом раствор аскорбиновой кислоты нагревают, регистрируют экстремальное значение суммарного светового потока и температуру его наступления [19].
Устройство для реализации способа определения аскорбиновой кислоты представлено на рисунке 3.

Рисунок 3. Устройство для определения содержания аскорбиновой кислоты 1 - источник света; 2 - измерительная ячейка; 3 - стеклянные окна; 4 - зеркала, 5 - фотоприемник; 6 - регистрирующий прибор; 7 - нагреватель; 8 - датчик температуры; 9 - регистрирующий прибор [19]
Разработана флуориметрическая методика определения подлинности и количественного содержания кислоты аскорбиновой, основанная на ее окислении до кислоты дегидроаскорбиновой с последующей конденсацией с о-фенилендиамином. Установлено, что для ее проведения необходимо использовать в качестве окислителя меди ацетат, в качестве стабилизатора контрольного раствора - натрия эдетат, рН раствора должно находиться в пределах от 4 до 5. Измерять величину интенсивности излучения следует регистрировать при длине возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 425 нм [19,20].
3 Экспериментальная часть
3.1 Выбор метода определения аскорбиновой кислоты
В настоящее время известны многочисленные способы идентификации и количественного определения аскорбиновой кислоты. Широко распространены титриметрические методы количественного определения кислоты, основанные на кислотно-основных и окислительно-восстановительных, такие как алкалиметрия, йодометрия, йодатометрия, перманганатометрия и другие. Недостатком указанных методик является невозможность их применения для определения аскорбиновой кислоты в многокомпонентных объектах без предварительного выделения кислоты. Для количественного определения аскорбиновой кислоты чаще всего используется титриметрический метод с применением в качестве титранта 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Однако этот метод имеет ряд ограничений, таких как невозможность получения достоверных результатов при исследовании окрашенных извлечений, а также частое завышение результатов, так как извлечение может содержать сумму веществ.
Метод кулонометрического и потенциометрического титрования применяется для определения сумму органических кислот. Поэтому недостатком способа является невозможность избирательного определения аскорбиновой кислоты.
Широкое применение получили и спектральные методы анализа. Известен способ фотоколориметрического количественного определения аскорбиновой кислоты, основанного на определении оптической плотности окрашенного продукта взаимодействия кислоты с фосфорномолибденовой кислотой. Недостатком является громоздкость и длительность аналитических операций, нестабильность оптической плотности окрашенного продукта во времени, недостаточная чувствительность и селективность метода в присутствии других биологически активных веществ.
Метод флуориметрического определения, основанный на окислении кислоты в дегидроаскорбиновую, взаимодействии ее с о-фенилендиамином с образованием флуоресцирующего соединения и измерения интенсивности флуоресценции при длинах волн 350 нм возбуждающего и 430 нм излучаемого света. Спектроскопия ЯМР является надежным методом идентификации, но дорогостоящим.
Метод ВЭЖХ, позволяющий одновременно производить разделение, идентификацию и количественное определение компонентов в сложных смесях. Метод эффективный, также требует использование дорогостоящего оборудования.
Метод тонкослойной хроматографии (далее- ТСХ), обладая всеми преимуществами хроматографических методов, показывает эффективность применения при качественном и количественном определении аскорбиновой кислоты. Недостатком является также потребность в идентификации с использованием дорогостоящих сканеров распознавания и вычислительных действий над исследуемыми хроматографическими зонами. Но проведение анализа отличается несложностью аналитических операций, хорошей воспроизводимостью, возможностью интерпретации результатов без использования специального оборудования. В настоящее время активно разрабатываются высокоэффективные методики определения веществ методами ТСХ и высокоэффективной тонкослойной хроматографии (далее -ВЭТСХ- на этой основе открываются большие возможности в идентификации и количественном определении многих органических веществ [22,23,24,25,26,27].
3.2 Методика получения, идентификации и количественного определения аскорбиновой кислоты из растительного сырья методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии.Теоретически обоснованы и подобраны условия хроматографирования аскорбиновой кислоты в тонком слое сорбента с количественной интерпретацией полученных данных метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии (далее- ВЭТСХ). В качестве растительного сырья использованы плоды шиповника. Выбрана методика получения и определения аскорбиновой кислоты методом ВЭТСХ, проявитель -водный раствор нитрата серебра с целью изучения как одного их методов идентификации, получения навыков проведения такого вида инструментального анализа.
3.2.1 Оборудование, средства измерения, посудавесы аналитические, колба плоскодонная 50 мл со шлифом -2 штуки, обратный холодильник, водяная баня, микропипетки, пипетка 10 мл, хроматографические пластинки марки Sorbfil (размером 10ⅹ10 см, тип сорбента-силикагель, зернение 5-17 мкм, толщина слоя 90-120 мкм, связующее-силиказоль), хроматографическая камера, УФ-лампа, пульверизатор, сушильный шкаф, бумажный фильтр «красная лента»
3.2.2 Растворы и реактивыРСО аскорбиновой кислоты
70 % раствор этилового спирта С2Н5ОН;
0,01 М раствор нитрата серебра AgNO3 - 17,0 г серебра нитрата растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл; далее для приготовления 0,01 М раствора 50,0 мл 0,1 М раствора серебра нитрата разбавляют водой до объёма 500,0 мл.
Элюирующая система: 1-бутанол: уксусная кислота: вода в соотношении 4:1:5 или 1-бутанол: муравьиная кислота: вода в соотношении 5:0,5:2
Для приготовления стандартных растворов РСО аскорбиновой кислоты рекомендуется использовать только ее особо чистые твердые препараты и хранить растворы на холод в склянках из темного стекла. Для стабилизации растворов аскорбиновой кислоты целесообразно добавлять к ним ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и муравьиную кислоту. Например, раствор аскорбиновой кислоты, содержащий около 0,1 г ЭДТА и 4 г НСООН в 1 л, довольно устойчив: концентрация уменьшается в течение суток не более, чем на 0,1%.
3.2.3 Подготовка к анализу. Построение калибровочного графикаПриготовление раствора РСО аскорбиновой кислоты: 0,025 г (точная навеска) РСО аскорбиновой кислоты растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в 10 мл 70% этилового спирта. Доводят объем раствора до метки 70% этиловым спиртом и перемешивают: полученный раствор 1000 мкг\мл разводят в 10 раз до концентрации 100 мкг\мл.
РСО аскорбиновой кислоты наносим на хроматографическую пластинку с концентрацией вещества 1 мкг; 2мкг;3 мкг;4мкг;5мкг;6мкг;10 мкг. Растворы наносят на расстоянии друг от друга 1-2 см, стартовая линия на расстоянии 1,5-2 см от края. Пластинку помещаем в подготовленную хроматографическую камеру (не менее, чем за час до внесения пластины в камеру налить элюент, подъем раствора должен быть не более 0,5 см). После подъема раствора на расстояние не менее 7-8 см, пластину вынимаем, просушиваем. Хроматограмму обрабатываем реагентом 0,01 М раствором нитрата серебра из пульверизатора, сушим в УФ-свете течение 3-5 минут до проявления хроматографических зон (темно-серые пятна на белом фоне). Предел обнаружения 1∙10-6 г.
Обнаруженные зоны определения вещества определяем количественно с помощью миллиметровой бумаги, рассчитывая площади окрашивания. На основании полученных данных строим график зависимости площади зоны от содержания вещества в мкг.
Получены следующие результаты.

Рисунок 4. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов

Рисунок 5. Градуировочный график
Выполнение анализа по определению содержания аскорбиновой кислоты в сырье: в колбу емкостью 50 мл со шлифом помещаем 1,0000 г измельченных плодов шиповника, прибавляем 100 мл 70% этилового спирта, присоединяем обратный холодильник и нагреваем на водяной бане в течение 15 мин. Полученное извлечение фильтруем через фильтр «красная лента». На линию старта пластинки Sorbfil наносим 3,5,10 мкл. Затем помещаем в насыщенную хроматографическую камеру (1-бутанол:уксусная кислота: вода в соотношении 4:1:5, за час до внесения пластины, объем элюента покрывает пластину на высоту не более 0,5 см), хроматографируем восходящим способом, после подъема фронта растворителей, сушим пластину, обрабатываем проявителем- 0,01 М раствором нитрата серебра, высушиваем в течение 5 минут в УФ-свете до появления хроматографических пятен. Высота подъема около 7 см.

Рисунок 6. Хроматограмма извлечения вещества: 1-3 мкл,2-5 мкл,3-10 мкл.
Внесены три пробы в количестве 0,1 мкл с полученным результатом площади пятен 118 мм2, 118,5; 118,4, что соответствует содержанию вещества 10,00 мкг,10,043;10,034.
3.2.4 Обработка результатов анализаСтатистическая обработка результатов: Sorbfil наносим =∑(хn)\n=10,026 мкг
Определяют стандартное среднеквадратичное отклонение отдельного измерения Sn, которое является мерой разброса опытных данных и характеризует случайную ошибку метода испытаний, по формуле:
Sn2=√ (n∑хi2-∑xi2)\n(n-1)=0,0005145
S=√S2=0,023
Определяют среднеквадратичное отклонение среднего арифметического значения St : St=S\√n=0,023\√3=0,013
Показатель точности исследования (Е, %) определяют по формуле:
Е= (S\хср.ариф)100%=0,13%
Результаты коррозионных испытаний считываются удовлетворительными, если Е≤10 %.
Доверительный интервал: хi ±t(p(90%)∙s=10,026±0,013
Содержание аскорбиновой кислоты: 10,026 мкг в 0,1 мл= концентрации 100,26 мкг\мл, содержание вещества 0,010026 г в 1 г плодов шиповника:
Содержание аскорбиновой кислоты=(0,010026\1)∙100%=1 %
Содержание аскорбиновой кислоты в плодах шиповника обычно оценивается в пределах 1-5 %, низкое содержание вещества объясняется качеством исходного сырья.
ЗаключениеЦелью курсовой работы было изучение структуры и свойств аскорбиновой кислоты, методов ее получения, отработка выбранного метода получения и определения аскорбиновой кислоты.
Выбранный метод получения и определения аскорбиновой кислоты-высокоэффективная тонкослойная хроматография- в многочисленных исследованиях доказывает свою презентативность, эффективность.
Полученные результаты говорят о содержании аскорбиновой кислоты в объекте- плодах шиповника, отработана методика работы с пластинами тонкослойной хроматографии, принципы и условия получения результатов, но изучение материалов дало информацию о некоторых недостатках используемого метода: существует вероятность экстракции вместе с аскорбиновой кислотой других биологически активных веществ, кроме этого выбранный детектирующий агент (проявитель нитрат серебра) неспецифичен для кислоты, что может привести к завышенным результатам эксперимента. В научной литературе отмечается эффективность применения специфичных проявителей, такого как 0,2 % спиртовый раствор 2,6 - дихлорфенолиндофенолята натрия или 5%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты. В любом случае использование тонкослойной хроматографии дает доверительные результаты и может быть использовано в исследованиях на содержание, идентификацию, качественного и количественного определения веществ.
Полученный опыт проведения анализов и изучения материалов составляют знания, помогающие реализации целей обучения, формирования профессиональных компетенций.
Список используемой литературы
[Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL:https://studwood.ru/1548992/matematika_himiya_fizika/himicheskie_fizicheskie_svoystva_vitamina[Электронный ресурс]-Режим доступа: -URL: https://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_523.htm[Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://studopedia.su/12_113972_himicheskie-svoystva.htmlДокучаева, Е. А. Общая биохимия: Витамины: практикум / Е. А. Докучаева, В. Э. Сяхович, Н. В. Богданова; под ред. С. Б. Бокутя. – Минск: ИВЦ Минфина, 2017 – 52 c.
Справочник химика, том 1. Никольский Б. П. 2-е изд. перераб. и доп.-М.:1966. 3. Органическая химия. Петров А. А., Бальян Х. В., Трощенко А. Т. Учебник для вузов/ Под ред. Петрова А. А.-4-е изд. перераб. и доп.
[Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://argovera.ru/article/vsyo-o-vitamine-c-askorbinovaja-kislotaА.Д.Таганович, В.К.Кухта, Т.С.Морозкина: Биологическая химия: витамины; Изд.: КРОКУС, 2008.
Суточная норма витамина С. Польза и механизм действия витамина, автор: Н.А.Коробина; 2011.
Климова, Е. В. Пищевые продукты как источник витамина С в питании населения Российской Федерации / Е. В. Климова // Пищевая и перерабатывающая промышленность. Реферативный журнал. – 2008. – № 3. – С. 667.
[Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://pharmedu.ru/publication/istoriya-sozdaniya-askorbinovoj-kislotyРеферат: Технология производства аскорбиновой кислоты. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://www.kazedu.kz/referat/191059Касаткин А.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии : Учебник для вузов.- 10-е изд., стереотипное, доработанное.- М.: ООО ТИД «Альянс», 2004-753 с. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://docviewer.yandex.ruБеликов, В. Г. Фармацевтическая химия : учеб. пособие /Беликов В. Г. - 4-е изд., перераб. и доп. - М. : МЕД пресс-информ , 2007 . - 622 с. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=875796H. W. Siesler, in Reference Module in Materials Science and Materials Engineering, 2016. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://www.sciencedirect.com/topics/materials-science/infrared-spectroscopyВыпускная квалификационная работа по теме: Методы анализа кислоты аскорбиновой в растворе для инъекций и их валидация. /Руководитель Саморядова А.Б. – ПМФИ. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://studfile.net/html/2706/606/html_m_H1v3aEcP.earb/img-VhfzRA.pngМеждународная фармакопея. Изд. 3-е, Т.2. Спецификация для контроля качества фармацевтических препаратов.- М.: Наука, 1990.- 364 с. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://www.bibliofond.ru/view.aspxФармацевтическая химия: учебное пособие / под ред. А. П. Арзамасцева - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 640 с. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=875796ГОСТ 31643-2012 Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Переиздание).-  . М.: Стандартинформ, 2019. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://docs.cntd.ru/document/1200095393?section=status[Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://www.bibliofond.ru/view.aspx?id=875796 Sona Skrovankova , Jiri Mlcek , Jiri Sochor. Determination of Ascorbic Acid by Electrochemical Techniques and other Methods. -Int. J. Электрохим. Sci., 10 (2015) 2421 – 2431. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0Государственная фармакопея Российской Федерации, XII изд., Часть 1, Научный центр экспертизы средств медицинского назначения, Москва (2008). [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://pharmacopoeia.ru/gosudarstvennaya-farmakopeya-xiii-online-gf-13-online/М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец, Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, Т. 2, Мир, Москва (1980), с. 610.
G. S. Chakraborthy, J. Young Pharmacists, 1(1), 82 – 85 (2009); doi:10.4103/0975 – 1483.51878.
Ю. В. Танская, О. И. Попова, Труды научно-практической конф. «Фармация из века в век», Ч. III, Санкт-Петербург (2008), сс. 151 – 155.
B. Franciszek, B. Szpikowska-Sroka, M. Gałkowska, J. Planar Chromatography, 18; DOI: http://dx.doi.org/10.1556/JPC.18.2005.5.6
E. L. Ponder, B. Fried, J. Sherma, Acta Chromatographica, 14, 70 – 81 (2004).
Тринеева, О. В. Валидация методики определения аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии / О. В. Тринеева, Е. Ф. Сафонова, А. И. Сливкин // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2017. – Т. 17. – № 3. – С. 414-421. [Электронный ресурс]- Режим доступа: -URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=11613386R. Ragupathi Raja Kannan, R. Arumugam, S. Meenakshi, P. Anantharaman, Int. J. Chem. Tech. Res., 2(3), 1526 – 1530 (2010).
K. M. Younes, M. A. Basha, Y. Maissa, et al., Pharma Chem., 6(2), 111 – 121 (2014).
Государственная фармакопея Российской Федерации, XIII изд.: в 3 т., Министерство здравоохранения Российской Федерации, Москва (2015); режим доступа: http://www.femb.ru/feml.
О. Б. Рудаков, И. А. Востров, С. В. Федоров и др., Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии, «Водолей», Воронеж (2004).
Ф. Гейсс. Основы тонкослойной хроматографии, Мир, Москва (1999).
Патент РФ 2581456, МКП G01N30/94, Способ идентификации и количественного определения аскорбиновой кислоты, О. В. Тринеева, И. И. Сафонова, А. И. Сливкин и др.; заявитель и патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет», № 2014141086/28; заявл. 10.10.2014; опубл. 20.04.2016, Бюл. изобрет., № 11 (2014).
Сергунова, Е. В. Изучение экстракционных препаратов шиповника / Е. В. Сергунова, А. А. Сорокина, М. А. Корнюшина // Фармация. – 2012. – № 2. – С. 14-16.