Плазмиды как векторы для геномодификации клеток бактерий

 Примерный план работы:

1) Привести примеры геномодифицированных бактерий, продуцирующих целевые белки, имеющие важное хозяйственное значение в биотехнологической промышленности.

2) Характеристика плазмид. Особенности строения и примеры плазмид.

3) Характеристика рекомбинантных плазмид, содержащих чужой ген и или генетический элемент. Особенности и примеры таких плазмид.

4) Перспективы развития генной инженерии.

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Профилактическое и терапевтическое применение генетически модифицированных бактерий не является новой идеей. В начале 1990-х такие предложения широко обсуждались, несмотря на то, что CRISP/Cas9 (сгруппированные, регулярно расположенные интервалы, короткие палиндромные повторы), нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и другие виды генной инженерии. технологии были недоступны.Гораздо раньше, в 1940-х годах, вирусы, обладающие сродством к солидным опухолям, а впоследствии и бактерии со сходными свойствами такие как Salmonella typhimurium, уже привлекали внимание. Впоследствии была выдвинута гипотеза о генетических манипуляциях с такими микробами для превращения их в носители противораковых средств и других лекарств.Биотехнологическое производство лекарств с использованием генно-инженерных организмов, таких как кишечная палочка и дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris в настоящее время являются отраслевым стандартом. Кишечный микробиом может обеспечить долгосрочная персональная платформа для производства, а также выпуска низких доз необходимой молекулы, особенно если она обычная комменсалы были отобраны для генетических манипуляций. Такое специальное лечение было бы элегантным дополнением к точности лекарственное средство.Salmonella typhimurium может колонизировать кишечник человека. В качестве организма, ищущего опухоль, манипулируемый штамм, экспрессирующий флагеллин B (FlaB) подавлял опухоли и метастазы и обеспечивал пролонгированное выживание за счет TLR-5e-зависимого механизм на мышиной модели. Модифицированный штамм того же вида был экспериментально наделен свойствами против меланомы с помощью экспрессия гамма-интерферона.Генетически модифицированные штаммы E. coli Nissle 1917 для лечения нарушений цикла мочевины и фенилкетонурии продвижение. Чувствительные к воспалению бактерии, способные как диагностировать, так и управлять терапевтическим ответом у пациентов с ВЗК также преследуются [95]. По крайней мере, одна молекулярная основа для такого противовоспалительного результата, а именно а-МСГ, уже установлена. были выяснены, как ранее упоминалось в исследовании Qiang et al. ВВЕДЕНИЕТехнологическое применение биологических агентов, а именно использование бактерий с целью получения конкретных продуктов или проведения контролируемых направленных изменений, является основой биотехнологии.Тысячи лет назад человек, ничего не зная о биотехнологиях, использовал их в своем хозяйстве – он варил пиво, занимался виноделием, пек хлеб и делал молочнокислые продукты и сыры.В современном мире практическое значение методов биотехнологии с использованием бактерий трудно переоценить – они применяются в пищевой промышленности и сельском хозяйстве, в медицине и фармакологии, при добыче полезных ископаемых и их переработке, в процессе очистки воды в природе и в септиках, во многих сферах жизни человека.Методы генно-инженерного вмешательства изменяют клетки микроорганизмов и дрожжей, превращая их в эффективных производителей любого белка. Что открывает широкие возможности использования генно-модифицированных клеток микробов и дрожжей для получения конечного организма с заданными характеристиками.Использование генно-мутированных клеток микробов и дрожжей человеком в повседневной жизни вызывает обоснованные опасения – много как сторонников генно-измененных веществ, так и их противников.Однако фактом остается отсутствие информации о воздействии генно-модифицированных клеток бактерий и дрожжей на организм человека и природу в целом.Генно-модифицированные бактерии и энергияГенетики работают над вопросом альтернативного источника энергии. Основной задачей является создание химического сырья, а далее топлива как продукта бактериального метаболизма.Одним из направлений получения человеком энергии от бактерий является работа с генно-модифицированными цианобактериями.Биологи Тюбингенского университета обнаружили микроорганизмы, обладающие свойствами батарейки и способные как аккумулировать энергию, так и передавать ее другим бактериям.Энергию, вырабатываемую этими бактериями, человек может использовать для наноприборов.В Китае построен прибор, в котором бактерии получают водород из ацетатов, при этом внешнего источника энергии у аппарата нет, а сырьем служат дешевые отходы производства. В свою очередь водород является источником энергии для эко-автомобилей.Микробиологи в университете Южной Каролины обнаружили бактерию, способную вырабатывать энергию, питаясь токсичными отходами, такими проблемными как полихлорированные бифенилы и агрессивные растворители.Калифорнийские исследователи предложили методику переработки бурых водорослей модифицированной кишечной палочкой, получая на выходе этиловый спирт – прекрасный источник энергии.Водород, как источник энергии, получили американские ученые при разложении анаэробными бактериями глюкозы.Плюсы и минусы ГМО (генетически модифицированный организм)Использование человеком в повседневной жизни генно-модифицированных бактерий и дрожжей для получения измененных организмов имеет как положительные, так и отрицательные стороны.К плюсам генно-модифицированных организмов относят:производство любых органов для трансплантации, которые не будут отторгаться;производство исходного материала для биотоплива;производство лекарственных препаратов;создание растений для технических целей (производство тканей и т.д.).Известные минусы генно-модифицированных продуктов:себестоимость генно-модифицированных овощей и фруктов почти на 30% выше натуральных;семена и плоды ГМ-растений нежизнеспособны;поля с ГМ-посадками требуют повышенного количества пестицидов и гербицидов;культурные ГМ-растения способны производить гибриды с дикими растениями. 1. Генно-инженерные микроорганизмы и регулирующий надзор за их использованием в современном производстве продуктов питания.Микроорганизмы использовались на протяжении всей истории человечества для помощи в производстве, например, продуктов питания, даже до того, как люди узнали, что эти организмы несут ответственность за задействованные процессы ферментации (Jay, Loessner, and Golden, 2005; Zhang, Sun, and Ma, 2017).Микроорганизмы, как правило, за счет производства своих эндогенных ферментов, на протяжении тысячелетий играли решающую роль в производстве таких продуктов, как пиво, йогурт, кефир, сыр, соевый соус, вино, уксус и многих других. После открытия ответственных за это микроорганизмов в 1830-х годах (Barnett 2003) производители продуктов питания начали изучать способы использования этих микроорганизмов, чтобы сделать их более эффективными. Хотя людям потребовались тысячи лет, чтобы обнаружить микроорганизмы, ответственные за существование многих пищевых продуктов, после их обнаружения потребовалось всего около ста лет (и открытие ДНК), чтобы люди начали использовать методы оптимизации использования микроорганизмов, в том числе модификация их генетического состава, чтобы сделать производство продуктов питания с использованием микроорганизмов более эффективным.В генетический состав микроорганизмов вносятся модификации либо для производства нового белка или другого пищевого ингредиента, либо для улучшения/увеличения производства существующего белка/ингредиента, либо для адаптации характеристик существующего белка к новому применению. Для внесения генетических изменений в микроорганизмы используются несколько методов, и термин «генно-инженерные микроорганизмы» (GEM) конкретно относится к микроорганизмам (т. для выполнения определенной функции. Существует много других методов модификации генетического состава микроорганизмов, но не все из этих методов подпадают под нормативные определения генетически модифицированных или генетически модифицированных. Например, химический мутагенез и межвидовое скрещивание могут быть использованы для модификации генетического состава микроорганизма (Национальный исследовательский совет США, 2004 г.), однако эти методы обычно не подпадают под нормативные определения генно-инженерных (или генетически модифицированных в Европейский Союз). Далее в этой статье будут сравниваться некоторые из наиболее распространенных методов, используемых сегодня для модификации генетического состава микроорганизмов.Выдающиеся достижения в области биохимии и молекулярной биологии за последние несколько десятилетий привели к широкому использованию ГЭУ в производстве медицинских и пищевых веществ, тем более что эти процессы все чаще признаются экологически безопасными, безвредными для животных и экономически эффективными. средства производства. Например, инсулин теперь вырабатывается микробами, а не свиньями, которые приносят в жертву, чтобы получить их поджелудочную железу, первоначальный источник инсулина. Точно так же трипсин и химозин, произведенные микроорганизмами, доступны в качестве альтернативы сбору трипсина или сычужного фермента из животных источников, таких как свиньи и коровы. Преимущества производства GEM не ограничиваются заменой животноводческих методов производства. Например, по сравнению с традиционным сельскохозяйственным производством растительных веществ, таких как экстракты стевии и ваниль, производство стевиоловых гликозидов (Philippe et al. 2014) и ванилина (Brochado et al. 2010) на основе GEM имеет много преимуществ в области устойчивого развития, включая сокращение землепользования, производство меньшего количества отходов и обеспечение более стабильного и доступного предложения для удовлетворения растущего потребительского спроса.Отличным примером внедрения ГЭМ в качестве метода производства пищевых ингредиентов является производство рибофлавина с 1990-х годов по настоящее время, когда почти 100% коммерчески производимого рибофлавина производится с использованием ГЭМ (Schwechheimer et al. 2016). Другие примеры пищевых ингредиентов, производимых сегодня GEM, включают витамины, аминокислоты, функциональные белки (например, текстуранты), пищевые белки, олигосахариды, ароматизаторы и подсластители (Adrio and Demain 2010).Еще одна область, в которой ГЭМ нашли широкое применение, — это производство пищевых ферментов (Olempska-Beer et al. 2006). Пищевые ферменты обычно используются в производстве продуктов питания для достижения ряда различных технических эффектов, таких как: снижение содержания лактозы в пищевых продуктах (лактаза), укрепление теста или модификация крахмала при выпечке (амилазы), очистка растительного масла (фосфолипаза), производство кофе (маннаназы). ), переработка фруктов и овощей (пектинэстераза), превращение крахмала в сахара и специальные продукты (карбогидразы, такие как амилаза, глюкоамилаза и трансглюкозидаза) и гидролиз белков (протеаза). И последнее, но не менее важное: сыр можно изготавливать с использованием химозина (активного фермента, коагулирующего молочный белок в сычужном ферменте), полученного с помощью GEM, вместо сбора фермента из желудков телят.Ферменты — это белки, обладающие каталитическими функциями, которые можно использовать в пищевой промышленности. Микроорганизм продуцирует фермент из последовательности строительных блоков аминокислот, которые определяют его свойства, включая его каталитическую активность.2. Производство пищевых продуктов с использованием микроорганизмов.Производство пищевых веществ с использованием микроорганизмов называется ферментацией, которая представляет собой общий процесс, посредством которого микроорганизм преобразует источник энергии в другие вещества. Ферментация — это только первый шаг в производстве рафинированного пищевого вещества с использованием микроорганизма, независимо от того, является ли этот микроорганизм генетически модифицированным. Во время ферментации микроорганизм получает источник энергии и другие питательные вещества, которые затем превращаются в интересующее пищевое вещество. В отличие от ферментированных пищевых продуктов (например, йогурта, кефира, хлеба), в которых микроорганизм сохраняется нетронутым, пищевые вещества очищаются в несколько этапов, прежде чем использоваться в качестве функциональных ингредиентов или технологических добавок в других пищевых продуктах. В зависимости от производимого пищевого вещества и модификаций, внесенных в GEM, вещество может либо секретироваться микроорганизмом в ферментационную среду, либо GEM может подвергаться лизису для высвобождения вещества. Затем рафинация начинается со стадии извлечения, на которой пищевое вещество отделяется физическими средствами, такими как центрифугирование и/или фильтрация, от интактного микроорганизма и/или ферментационной среды. Затем за восстановлением следуют дополнительные этапы очистки, в зависимости от конкретного пищевого вещества, для удаления других веществ, которые могут присутствовать, таких как субстраты ферментации, белки, вещества, которые могли быть произведены микроорганизмом, интактные организмы GEM и рекомбинантная ДНК. О пищевом веществе, изготовленном таким образом, говорят, что оно «произведено с помощью» GEM (сокращение от «произведено с помощью» GEM), а не «произведено из» GEM.После того, как пищевое вещество было соответствующим образом очищено или очищено, оно может пройти дополнительные этапы окончательной обработки. Отделка может включать концентрирование жидких пищевых веществ, добавление стабилизаторов или консервантов, сушку пищевых веществ в порошок или добавление других материалов (таких как носители или гранулирующие агенты), в зависимости от потребности в конкретном пищевом веществе. В этом готовом состоянии эти пищевые вещества были полностью отделены от любого интактного организма, а также любой генетический материал (ДНК) от микроорганизма. Во всех случаях устанавливаются спецификации, включающие критерии как чистоты, так и примесей, чтобы гарантировать безопасность пищевого вещества.В то время как современные ферментационные производственные мощности могут показаться футуристическими, сами методы производства поразительно похожи на процессы производства продуктов питания, в которых микроорганизмы использовались на протяжении тысячелетий (таблица 1). Например, сравнение современного брожения с производством вина показывает, что эти процессы очень похожи. При производстве вина микроорганизмы (дрожжи) получают субстрат (сахара, присутствующие в виноградном соке), который затем микроорганизмы превращают в желаемое вещество (этанол). После завершения винного брожения используется этап извлечения для отделения желаемого продукта от микроорганизмов (в вине это называется осадком), и могут применяться дополнительные этапы очистки, такие как фильтрация. После восстановления и очистки вино проходит этапы отделки, такие как выдержка в дубовых бочках перед розливом в бутылки.Таблица 1.Пищевой ингредиентПищевой ферментВиноФерментацияИсточник энергии преобразуется микроорганизмом в пищевой ингредиентИсточник энергии преобразуется микроорганизмом в пищевой ферментИсточник энергии (виноградный сок) преобразуется микроорганизмом в этанолВосстановлениеФизическое отделение пищевого ингредиента от интактного организма с последующими дополнительными этапами очисткиФизическое отделение интактного или инактивированного организма от фермента с последующими дополнительными этапами очистки и концентрированияФизическое отделение вина от интактного организма (осадка) с последующим дополнительные этапы очисткиОкончаниеПищевые ингредиенты концентрируются или сушатся до порошкообразного состоянияФерментный концентрат превращается в жидкий или сухой продуктВино выдерживается в дубовых бочках и разливается в бутылкиКонечный продуктДолжен соответствовать спецификациям для пищевых продуктовДолжен соответствовать спецификациям по содержанию загрязняющих веществ в пищевых ферментахДолжен соответствовать спецификациям, таким как концентрация этанола и органолептические характеристики3. Общие методы модификации генетического состава микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов.Многочисленные штаммы микроорганизмов используются в производстве пищевых веществ с использованием описанного выше процесса. Микроорганизмы, используемые в этом процессе, обычно должны быть модифицированы, если они уже не обладают всеми характеристиками, необходимыми для экономичного производства желаемого пищевого вещества в масштабе. Использование немодифицированных микроорганизмов наиболее распространено в традиционных пищевых процессах, таких как те микроорганизмы, которые используются в коммерческом производстве хлеба, вина и пива, а также йогурта, и иногда все еще используются сегодня в производстве некоторых пищевых ферментов. Тем не менее, генетическая модификация микроорганизма часто необходима для производства желаемого вещества в целом (например, если исходный организм, который естественным образом производит интересующее вещество, не может быть культивирован в больших масштабах), или генетическая модификация может использоваться для повышения эффективности и снижения затрат. производства эндогенного фермента или другого пищевого вещества. В следующем разделе обсуждаются четыре метода, которые можно использовать для генетической модификации микроорганизмов для производства пищевых веществ.4. Нецелевой мутагенезДо появления современной биотехнологии микроорганизмы генетически модифицировались в течение многих десятилетий путем применения давления отбора или случайного мутагенеза, вызванного химическими веществами или УФ-облучением. Модификационные подходы, основанные на классическом мутагенезе и селекции, не являются целевыми, поскольку они вносят случайные изменения ДНК, за которыми следует обширный скрининг для отбора микроорганизмов на предмет повышенной продукции определенного фермента или желаемого фенотипического признака. Окончательный генетический состав микробов, полученных в результате случайного мутагенеза, нельзя предсказать заранее, и даже доступное сегодня высокопроизводительное секвенирование ДНК не всегда дает полную ясность всех изменений ДНК или их последствий.В целом, полезность этого подхода сегодня ограничивается изменением признаков, генетическая основа которых недостаточно изучена, и дальнейший прогресс в области молекулярной биологии, вероятно, приведет к тому, что он будет в значительной степени заменен более точными методами введения генетических модификаций с помощью методов современной биотехнологии. Однако случайный мутагенез с последующим повторным тестированием стал основой для разработки нескольких надежных, хорошо охарактеризованных и безопасных микробных производственных платформ (так называемых безопасных линий штаммов) для экспрессии новых признаков с помощью генной инженерии (см. ниже), таких как Bacillus subtilis. (US FDA 2018a; Ladics and Sewalt 2018), B. licheniformis (US FDA 2017; Sewalt, Reyes, and Bui 2018) и Trichoderma reesei (US FDA 2018b).5. Генная инженерия/биоинженерия/редактирование геномаСегодня основным механизмом создания GEM для производства пищевых веществ являются методы in vitro с использованием нуклеиновых кислот, включая вставку генов с помощью рекомбинантной ДНК или родственных методов в выбранный, надежный и безопасный микроорганизм, который придает этому организму улучшенные или новые функциональные возможности. Полученный в результате микроорганизм называется генетически модифицированным; этот термин отличается от термина «генная модификация» Национальным исследовательским советом США (Национальный исследовательский совет США, 2004 г.) и принят в словаре различных нормативных руководящих документов США и Канады. .С генной инженерией ученые начинают с выбора или разработки надежного, продуктивного микроорганизма-хозяина, который, как известно, является безопасным (непатогенным и не продуцирующим токсины). После выбора/разработки подходящего экспрессионного хозяина используются молекулярные методы для вставки или удаления одной или нескольких последовательностей ДНК в геном микроорганизма, которые усиливают существующие или придают этому организму новые функциональные возможности. Примеры видов новой или улучшенной функциональности включают: производство фермента или другого функционального белка, который предназначен для выделения из микроорганизма для использования в производстве пищевых продуктов (например, α-амилаза, липаза, протеаза, белок со структурой льда, леггемоглобин), производство ферментов, которые помогают самому микроорганизму производить другой пищевой ингредиент (например, рибофлавин, стевиоловый гликозид или олигосахарид), или дополнительные модификации, такие как удаление эндогенных генов или вставка переносчиков, направленные на то, чтобы сделать микроорганизм более эффективной производственной платформой. В состав последовательностей ДНК, обеспечивающих экспрессию новой или улучшенной функциональности, входят последовательности, кодирующие элементы (например, промоторные и терминаторные последовательности), помогающие контролировать экспрессию функциональных генов в микроорганизме. Хотя последовательности ДНК могут быть вставлены в геном микроорганизма случайным образом, часто эти последовательности преднамеренно встраиваются в определенные точки (называемые «локусами») генома микроорганизмов. Несмотря на это, сайт вставки может быть позже подтвержден путем секвенирования всего генома.Источник ДНК, который экспрессируется генно-инженерным микроорганизмом, может быть эндогенным, из того же организма (например, для производства большего количества существующего фермента), или экзогенным, из другого организма. Когда ДНК получена экзогенно из близкородственного микроорганизма, способного к естественному обмену ДНК (часто в пределах одного рода). этот процесс также называется «самоклонированием» в некоторых нормативно-правовых актах. Однако источником экзогенной ДНК часто является другой, более отдаленный микроорганизм, который невозможно эффективно выращивать в промышленных условиях. Именно благодаря созданию нового биоинженерного организма сумма встроенных последовательностей достигает своего полного потенциала, чтобы стать микроорганизмом, способным производить желаемые пищевые вещества в промышленных масштабах. Таким образом, термин «биоинженерия» является более узким термином, обозначающим этапы генной инженерии или редактирования генома, результатом которых является модифицированный организм, который не существует в природе или не может быть получен путем традиционной селекции и селекции. Применительно к пищевым продуктам термин «биоинженерный» является нормативным термином, определяющим требования к потребительской маркировке.В то время как первоначально ДНК была выделена из одного микроорганизма, затем амплифицирована и перенесена в другой микроорганизм, сегодня синтетические последовательности ДНК, созданные с помощью других методов молекулярной биологии, могут быть вставлены в микроорганизмы для придания им функциональности. Использование синтетической ДНК (а не ДНК, физически выделенной из другого микроорганизма) позволяет очень быстро разрабатывать генно-инженерные микробы, производящие множество вариантов ферментных белков, которые можно тестировать в целевом приложении. Кроме того, использование синтетической ДНК полностью исключает непреднамеренное введение непреднамеренных последовательностей, таких как остатки клонирования ДНК, включая даже патогены. Использование синтетической ДНК позволяет молекулярным биологам ограничить перенос только интересующей полезной последовательностью гена, никогда не вступая в контакт с патогеном и избегая переноса последовательностей, которые могут кодировать патогенность. Соображения безопасности одного такого примера последовательности, происходящей от потенциального патогена, подробно описаны Sewalt, Reyes и Bui (2018) для последовательности α-амилазы из Cytophaga sp., безопасно экспрессируемой в Bacillus licheniformis, и доведены до сведения FDA для использования. в переработке углеводов (US FDA 2017).6. Белковая инженерияБелковая инженерия часто применяется для оптимизации функциональности ферментов (или других белков). Это может быть нацелено на повышение каталитической активности, но чаще используется для адаптации фермента к более эффективному функционированию в условиях применения, которые могут включать температуру, pH или концентрации соли, выходящие далеко за пределы оптимального диапазона для фермента. Например, амилазы для выпечки можно сконструировать таким образом, чтобы они дольше выдерживали высокую температуру в печи, так что такое же количество каталитических реакций может быть достигнуто с более низкой начальной концентрацией фермента до того, как фермент будет инактивирован в процессе выпечки.Начиная с эндогенного фермента дикого типа, эффективная белковая инженерия часто включает в себя создание множества вариантов путем генной инженерии производственного организма (особенно когда уровни экспрессии также необходимо увеличить) или, в качестве альтернативы, редактирование генов (просто для проверки воздействия). специфических аминокислотных изменений эндогенного белка). Эти несколько вариантов затем тестируются в приложении для получения нескольких «попаданий» с улучшенными характеристиками, иногда с последующим объединением этих совпадений в последовательных поколениях для максимального улучшения. Конечный выбранный вариант белка фермента может отличаться от последовательности дикого типа одной аминокислотой или несколькими аминокислотами.7. Редактирование генов и геномаНа сегодняшний день CRISPR является наиболее распространенным методом редактирования генов. CRISPR — это революционная технология, которая облегчает точное вырезание и склеивание ДНК с помощью специализированных белков, вдохновленных природой и разработанных исследователями. Белки редактирования генов бывают трех видов: цинковые пальцы, TALEN и CRISPR-Cas. CRISPR-Cas имеет элегантный дизайн и простую доставку клеток и в настоящее время используется для лечения генетических заболеваний, выращивания устойчивых к изменению климата культур и разработки дизайнерских материалов, продуктов питания и лекарств. CRISPR расшифровывается как Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats, фрагменты регулярно повторяющихся фрагментов ДНК, которые возникли у некоторых бактерий как древняя система защиты от вирусных вторжений (Barrangou et al. 2007). CRISPR-Cas представляет собой комплекс ферментов (белков Cas) и генетических направляющих (последовательности CRISPR), которые вместе находят и редактируют ДНК.Ученые использовали эту мощную систему CRISPR-Cas, разработав направляющие последовательности РНК, которые могут распознавать определенный код ДНК в любой живой клетке, представляющий генетический дефект или нежелательный признак, и вырезать одну или несколько пар оснований из этого кода ДНК. Замещающие нуклеиновые кислоты могут быть вставлены именно в то место, где целевая последовательность была прервана, для восстановления ДНК, модификации последовательности или введения нового полезного гена, вместо того, чтобы просто отключить функцию эндогенного гена. Применение биотехнологии в микробах было впервые описано в 2012 году исследователями из Медицинского института Говарда Хьюза (Jinek et al., 2012). Такой способ удаления, восстановления или модификации функции гена называется редактированием гена. Введение новых последовательностей ДНК в геном с помощью CRISPR-Cas называется редактированием генома. Описание различных методов и сравнение их результатов см. на рис. 1.Рисунок 1. Различия между методами генетической модификации (A) и результатами модификации/инженерии (B). 2. Плазмиды: определение, структура, функции, примеры.Многие бактерии обладают дополнительными молекулами ДНК в дополнение к их большему геному. Эти молекулы, называемые плазмидами, широко используются в области генной инженерии. Чтобы функционировать в лабораториях, эти плазмиды должны иметь происхождение (ori), которое позволяет им воспроизводиться внутри бактерий. Они также должны включать несколько рестрикционных ферментов, позволяющих вырезать и вставлять ДНК в геном.Плазмиду можно описать как носитель, способный переносить искусственно имплантированную ДНК. Он способен дублироваться внутри E. coli, а также посредством собственного процесса воспроизводить вставленную ДНК независимо от источника. Плазмиду можно рассматривать как чрезвычайно маленькую установку для производства ДНК. Важнейшее требование к «хорошей» плазмиде — захватить ту вставку, которую вы хотели бы вставить, и воспроизвести ее в достаточном количестве, и при этом не разрушить вставку.Плазмиды ОпределениеПлазмиду можно описать как молекулу на основе ДНК, которая отличается от хромосомной ДНК и способна реплицироваться независимо от нее. Они двухцепочечные и во многих случаях круглые. Плазмиды обычно обнаруживаются у бактерий, однако иногда они обнаруживаются и у эукариотических организмов (например, кольцо размером два микрометра, обнаруженное у Saccharomyces cerevisiae).Термин «плазмида» впервые был использован американским молекулярным биологом Джошуа Ледербергом в 1952 году. Джошуа Ледерберг был американским молекулярным биологом, известным своими исследованиями в области генетики, искусственного интеллекта, а также освоения космоса. Ему было всего 33 года, когда он получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1958 года за открытие, что бактерии могут спариваться друг с другом и обмениваться генами. Он был награжден премией вместе с Эдвардом Л. Татумом и Джорджем Бидлом, которые выиграли за свою работу в области генетики.Характеристики плазмидПлазмиды представляют собой ДНК-содержащие молекулы, присутствующие в бактериях, которые отличаются от хромосомы бактерий.Плазмиды присутствуют у архей, бактерий и других эукариот, включая дрожжи, а также растения.Они очень маленькие (пару тысяч пар оснований) обычно несут только один или два гена. Гены кольцевые, и у них общий источник репликации.Плазмиды реплицируются с использованием того же механизма, который воспроизводит геном бактерий. Некоторые плазмиды копируются примерно с той же скоростью, что и хромосомы. Следовательно, одна клетка может иметь только одну реплику плазмиды. Другие плазмиды копируются с большой скоростью, и в одной клетке может быть 50 или более копий.Плазмиды способны легко проникать в бактериальные клетки. Это происходит естественным образом и является возможной причиной быстрого развития устойчивости к антибиотикам в больницах и других местах. Плазмиды вводятся в бактерии во время лабораторных экспериментов, чтобы изменить клетку с помощью новых генов.Плазмиды представляют собой самореплицирующиеся внехромосомные молекулы ДНК небольшого размера, которые спорадически переносятся и обмениваются среди множества бактерий и различных доменов.Классификация плазмид обычно основана на группе несовместимости (определяемой их функциями репликации/разделения) или генетической информации, определяемой их ДНК. Группировка несовместимости использовалась для классификации плазмид видов Pseudomonas и Enterobacteriaceae на 26 групп несовместимости.Большинство плазмид действуют в пределах узкого круга хозяев, что допускает только внутривидовую трансмутацию и размножение. Тем не менее, избранная коллекция плазмид, известная как «широкий диапазон хозяев» (BHR), плазмиды (включая плазмиды P, Q.W.N. и C) могут переноситься и реплицироваться в огромном разнообразии бактерий. Плазмиды BHR могут обладать самотрансмиссивностью (Tra+ Mob+, Tra+) или способны к мобилизации, однако они не являются самотрансмиссивными (TraMob+, Tra+).Кольцевой фрагмент ДНК, автономно воспроизводящий ДНКМожет экспрессировать ген устойчивости к антибиотикам и быть изменен для производства представляющих интерес белков.Формы плазмидСуществует 5 форм плазмид;Открытый цикл: ДНК имеет разрезанную одну цепь.Расслабленный цикл: ДНК полностью не повреждена.Линейный: ДНК имеет свободные концы.Суперскрученная: ДНК полностью не повреждена, но в ней есть изгиб, который делает ее меньше.Суперскрученный денатурированный: немного меньше по размеру, чем суперскрученный.Размер плазмидыПлазмиды меньшего размера немногочисленны, и в каждой бактерии присутствует только одна плазмида большего размера.Размер плазмиды варьируется от нескольких пар оснований Кело до нескольких пар мегабаз, в зависимости от типа плазмиды.Одним из важных свойств плазмидной ДНК является горизонтальный перенос генов посредством процесса конъюгации.Плазмида представляет собой самовоспроизводящийся элемент, который наследуется каждой бактерией во время клеточного деления.Размер плазмидной ДНК обычно составляет от 1 до 2 кб (используется в генетических исследованиях), меньший размер облегчает ее создание и модификацию для генной инженерии.Кроме того, стабильность плазмидной ДНК очень высока. Он может оставаться стабильным в течение более длительного периода времени как в очищенном состоянии, так и в бактериальной клетке.Плазмида может быть использована во многих различных типах видов для экспериментов по переносу генов и генной терапии.Структура плазмидЧто касается структуры плазмид, то они состоят из кольцевой двухцепочечной ДНК. Круглая форма плазмид создается за счет того, что два конца двойных цепей соединяются ковалентными связями.Молекулы также очень малы по размеру, особенно по сравнению с ДНК живых организмов. Они варьируются от нескольких тысяч килобаз до нескольких сотен килобаз.Рисунок. Структура плазмид.Хотя большинство плазмид имеют ковалентно замкнутую круглую форму, некоторые плазмиды обладают удлиненной структурой и не имеют круглой формы. Как правило, плазмиды состоят из трех основных компонентов, которые включают:5.1. Ориджин репликации (репликон).Место начала репликации (ori) — это точное место в цепи, с которого начинается репликация. Для плазмид эта область в основном состоит из пар оснований АТ-Т, которые легче разделить при репликации.По сравнению с ДНК организмов, которая имеет много типов в репликации. Более того, плазмиды являются одним из немногих источников репликации, так как их размер меньше. Происхождение процесса, они содержат несколько регуляторов, которые участвуют в репликации (например, белки Rep).5.2. Полилинкер (множественные сайты клонирования).В плазмиде полилинкер (MCS) является одним из наиболее важных компонентов молекулы. Это связано с его способностью позволить студентам получить знания о процессе клонирования. Полилинкер представляет собой короткую последовательность ДНК, состоящую из нескольких участков для расщепления ферментами рестрикции.Таким образом, MCS обеспечивает простую вставку ДНК в процессе лигирования или расщепления рестрикционными ферментами. На месте расщепления разные полилинкеры способны разрезать цепь ДНК. Таким образом, любой из этих рестрикционных ферментов может разрезать плазмиду в определенных местах производителя, что позволяет вставить ДНК.5.3. Ген устойчивости к антибиотикам.Ген устойчивости к антибиотикам является одним из первичных элементов плазмид. Эти гены играют важную роль в развитии устойчивости к лекарствам (к любому или ко всем антибиотикам) и затрудняют лечение некоторых заболеваний.Плазмиды сегодня известны своей способностью переносить гены от одного вида или бактерии к другому в процессе конъюгации (контакта между клетками с последующим переносом содержимого ДНК). Благодаря этому процессу они могут придавать устойчивость к противомикробным препаратам различным видам бактерий.Хотя репликация плазмид дает преимущество бактериям (резистентность к определенным антибиотикам), она также может влиять на деление клеток бактерий из-за увеличения нагрузки репликации. Вот почему бактерии с плазмидами, как правило, менее заселены, чем бактерии без плазмид, из-за более низкой скорости клеточного деления.5.4. Некоторые другие компоненты плазмид включают.Промоторная область: промоторная область является частью плазмиды, ответственной за рекрутирование механизма транскрипции.Сайт связывания праймера: Сайт связывания праймера представляет собой небольшую последовательность ДНК, которая находится на одной цепи, которая обычно используется для облегчения процесса амплификации ПЦР, а также секвенирования ДНК.Селекционный маркер: ген устойчивости к антибиотикам (ARG) играет важную роль в развитии устойчивости к лекарствам, что позволяет проводить отбор бактерий, имеющих плазмиды. Помимо ARG некоторые плазмиды содержат другие маркеры селекции либо в природе, либо путем искусственного введения.Хотя плазмиды имеют множество общих характеристик, существует несколько видов плазмид.Типы плазмид.6.1. Классификация плазмид на основе функции.1. Плазмиды фертильности (F PLASMID)F-плазмида также известна как фактор фертильности или пола, определяющий сексуальность бактерий E. Coli. Клетки, содержащие эту плазмиду, обозначаются как F+, а клетки, в которых ее нет, обозначаются как F-. Бактерии F+ можно считать мужскими из-за того, что они могут действовать как доноры не только плазмиды, но и хромосомных генов, которые переносятся в F-клетки, действующие как реципиенты, и, следовательно, считаются женскими.Перенос осуществляется конъюгацией F+ клетки с F-клеткой. F-плазмиду можно описать как конъюгативную плазмиду.Мы обнаружили, что отличительной чертой F-плазмиды является то, что она способна существовать как индивидуальная сущность, которая реплицируется изолированно от хромосомной ДНК. Или он может быть интегрирован в хромосому как неотъемлемый компонент. Когда F-плазмида интегрируется в хромосому E. coli, бактериальная клетка переходит от P-клетки к Hfr-штамму (высокая частота рекомбинации).В хромосоме E. Coli существует множество участков, в которые может быть интегрирована F-плазмида. Место интеграции зависит от того, какая интеграция приводит к новому штамму Hfr. Для конъюгации F+ x F передается только плазмида. При конъюгации Hfr x F будут перенесены хромосомные гены, а иногда и F-плазмида.F-плазмиду можно описать как самопередающуюся плазмиду с двухцепочечными кольцевыми молекулами ДНК. Его молекулярная масса в 63 раза превышает число дальтонов, и у него есть несколько генов, которые контролируют, как плазмида переносится от донора к ресиверу. Любая мутация любого из необходимых генов приводит к прекращению передачи плазмиды.Поскольку F-плазмида может быть встроена в хромосому, которая находится в клетках ее хозяина, в некоторых случаях ее можно выделить или удалить из хромосомы E. Coli в ее несвязанном состоянии, образуя удлиненную плазмиду. Было обнаружено, что процесс вырезания не всегда совершенен в том смысле, что участки хромосомы E. cocci, которые соединяются с F-плазмидой, которая была линейно интегрирована, содержатся в вырезанной F-ДНК, а также некоторые части плазмиды. ДНК остается внутри хромосомы E. coli.F-плазмиды, которые содержат часть, представляющую собой хромосомную ДНК, были обозначены как F'-плазмиды. Если F-плазмида теряет определенные жизненно важные гены в процессе элиминации, плазмида становится несуществующей и, в конце концов, удаляется при делении клеток.Если F-плазмида переносится путем конъюгации с F-реципиентом, она способна передавать гены, которые несет на своих хромосомах. Таким образом, реципиент является диплоидным по отношению к переданным генам (поскольку теперь у него есть одна собственная копия и другая версия этого гена, которая передается через его F-плазмиду). Следовательно, обмен хромосомными генами может осуществляться через F’-плазмиды. Это известно как сексуальная индукция.Функции: Плазмиды фертильности (F PLASMID) несут гены фертильности (tra-гены) для облегчения конъюгации, то есть передачи генетической информации между двумя клетками.6.1.1. Плазмиды резистентности (R PLASMID).R-плазмиды, придающие резистентность к различным лекарствам по отдельности или множественную резистентность к нескольким антибактериальным агентам, были впервые обнаружены в Японии в 1950-х годах у Shigella dysenteriae, вызывающей гастроэнтерит. С тех пор эти плазмиды были обнаружены внутри кишечной палочки и других кишечных бактерий. Плазмиды представляют собой чрезвычайно опасную угрозу для медицинских наук.Массивные R-плазмиды с молекулярной массой от 30 до x 106 дальтонов способны самопередаваться в процессе конъюгации другим бактериям. Следовательно, они являются конъюгативными плазмидами, такими как F-плазмида.Меньшие R-плазмиды с молекулярной массой 5-6 х 106 дальтонов не передаются. Большинство самостоятельно передающихся больших плазмид, таких как R100 Shigella, которые придают множественную лекарственную устойчивость, состоят из 2 фрагментов ДНК, связанных друг с другом ковалентной связью, образуя однонаправленную кольцевую молекулу.Один сегмент ДНК известен как «фактор, передающий устойчивость» (RTF), другой содержит гены лекарственной устойчивости. RTF играет важную роль в функции переноса R-плазмиды. Он имеет диапазон в виде гена (гены переноса) наряду с другими, которые регулируют репликацию плазмиды в клетках-хозяевах.Гены устойчивости во втором сегменте продуцируют ферменты для уничтожения антибиотиков, таких как пенициллины, стрептомицин и хлорамфеникол. сульфаниламиды, канамицин, тетрацикл и другие.В некоторых бактериях, устойчивых к лекарствам, например, в штамме 29 Salmonella Typhimurium, ген устойчивости находится не в одной плазмиде, а в отдельных плазмидах разного размера. Это часто называют агрегацией плазмид.Мобильные элементы в сложных транспозонах могут содержать гены устойчивости к лекарствам. Их можно включать в плазмиды, получая плазмиду устойчивости к лекарствам. Итак, R-плазмиды могут состоять из транспозонов, каждый из которых несет по крайней мере один ген, придающий устойчивость к антибиотикам. Например, Tn 5, несущий ген устойчивости к канамицину, может быть добавлен к плазмиде R100 Shigella, что придает плазмиде способность бороться с антибиотиком.Помимо устойчивости к лекарствам, плазмиды также могут сделать бактериальных хозяев невосприимчивыми к вредным негативным эффектам, вызываемым тяжелыми металлами. Плазмидная резистентность к никелю, ртути, кобальту, мышьяку и кадмию была зарегистрирована у различных видов, принадлежащих к родам Pseudomonas, Escherichia, Salmonella и Staphylococcus.Функции: включают гены, создающие устойчивость к антибиотикам или ядам.6.1.2. Col-плазмиды.Col-плазмиды присутствуют во многих разновидностях E. coli и содержат гены, контролирующие производство семейства белков, известных как колицины. Колицины могут ингибировать рост родственных бактерий, не имеющих плазмиды толстой кишки (Cor).Было идентифицировано множество различных Col-плазмид, и каждая из них продуцирует колицины с особым механизмом ингибирования восприимчивых бактерий. Например, Col B отвечает за повреждение цитоплазматических мембран рассматриваемых бактерий, а Col E2 или Col E3 отвечает за деградацию нуклеиновых кислот.Подобно R-плазмидам и Col-плазмидам, они могут быть самопередающимися или нет. Крупные плазмиды Col, такие как Col I или Col V-K94, с молекулярной массой в 60 раз больше, чем 106 дальтон, являются самотрансмиссивными. Они обладают крошечным числом копий, обычно от одной до трех реплик на ячейку. Небольшие Col-плазмиды, такие как Col-El, обладают молекулярной массой, которая в 4-5 раз превышает количество дальтонов.Они обладают большим количеством копий, обычно от 10 до 30 копий на каждую клетку. Они самонепередаваемые, но могут быть мобилизованы с помощью F-плазмиды. Это означает, что если F+-клетка также имеет плазмиду Col-E1 и конъюгирует с F-клеткой и способна спариваться с F-клеткой, возможно, что плазмида Col-E1 может быть передана реципиенту через мостик для спаривания. который создается с помощью F-плазмиды. Очевидно, клетки F-ColEl+ не способны переносить Col-плазмиду в другую клетку, поскольку она не способна построить мостик спаривания.В отличие от этого, большие Col-плазмиды являются самопередающимися, поскольку они обладают генами для самостоятельного построения аппарата конъюгации и не полагаются на передачу своих генов клеткам F-плазмидами. Как и в случае с F и большими R-плазмидами, большие Col-плазмиды также функционируют как конъюгативные плазмиды.Колицины являются частью широкой группы белков, известных как бактериоцины. Было замечено, что различные бактерии производят бактериоцины, которые могут убивать другие, связанные или не связанные с бактериями. Создаваемые белки кодируются генами, обнаруженными в бактериоциногенных (плазмидах).Бактериоцины, продуцируемые разными бактериями, можно идентифицировать по разным названиям, например, пиоцин, продуцируемый Pseudomonas aeruginosa, мегазин, продуцируемый Bacillus megaterium, и низин, продуцируемый лактобациллами, и так далее. Бактериоцины обычно проявляют свои антибактериальные эффекты, прикрепляясь к клеточной стенке клеток-мишеней. Они также работают, блокируя один из основных метаболических процессов, таких как репликация нуклеиновой кислоты, процесс транскрипции, синтез белка или метаболизм энергии.Бактериоцины, которые вырабатываются бактериями в кишечной среде, помогают поддерживать природный баланс в толстой кишке человека. Другие бактериоцины, созданные бактериями в естественной среде, могут работать, устраняя конкуренцию. Низин, вырабатываемый молочнокислыми бактериями, используется в коммерческих целях для консервирования молочных продуктов и пищевых продуктов.Функции: Плазмиды Col содержат гены, кодирующие антибактериальные полипептиды, известные как бактериоцины. который убивает разные штаммы бактерий. Белки, входящие в состав col E. Coli, содержат такие белки, как Col E1.6.1.3. Деградативные плазмиды.Диссимиляция или деградация органических соединений в процессе минерализации обычно контролируется плазмидными генами многочисленных микроорганизмов. Плазмиды, содержащие гены, кодирующие катаболизм органических соединений, обычно называют диссимиляционными или деградативными. Например, у таких видов, как Pseudomonas, как хромосомные, так и плазмидные гены генерируют ферменты, помогающие разлагать сложные соединения.Некоторые плазмидные гены кодируют ферменты, разлагающие такие необычные соединения, как камфора, толуол и салицилат нафталина, а также сложные углеводороды из сырой нефти. Используя эти ферменты, бактерии могут использовать эти соединения для производства источников углерода и энергии.Это означает, что бактерии с деградирующими плазмидами имеют больше шансов на выживание в условиях, в которых эти уникальные вещества находятся на рынке. Нормальные бактерии, у которых отсутствуют такие ферменты, кодирующие плазмиды, будут уничтожены в аналогичных условиях.Способность организмов, несущих деструктивные плазмиды, которые могут метаболизировать различные комплексные соединения, позволяет использовать их для помощи в процессе биоремедиации загрязненной окружающей среды. Появление методов генной инженерии побудило ученых создать генетически улучшенные штаммы бактерий, содержащие плазмиды, способные расщеплять различные сложные химические вещества, подобные тем, которые естественным образом содержатся в сырой нефти.Синтетический штамм Pseudomonas был создан Анандамоханом Чакраборти из Университета Иллинойса, США, что открывает перспективы, которые можно использовать в будущем для устранения разливов нефти в океанах в результате утечек в танкерах с сырой нефтью. Разливы нефти представляют серьезную угрозу для морской жизни, включая растения и животных.Функции: Разлагающие плазмиды позволяют переваривать необычные вещества.6.1.4. Плазмиды вирулентности.Вирулентные плазмиды могут придавать патогенность бактериям-хозяевам. Они делают бактерию патогенной, потому что бактерия становится лучше приспособленной для борьбы с защитой хозяина или для производства токсических веществ.Например, Ti-плазмиды, принадлежащие Agrobacterium tumefaciens, могут вызывать болезнь, известную как корончатый галл, у покрытосеменных растений. Энтеротоксигенные виды E. coli вызывают диарею путешественников из-за плазмиды, кодирующей энтеротоксин, который вызывает выделение солей и воды в кишечнике.Функции: Плазмиды вирулентности превращают бактерию в патоген.6.1.5. Эписома.Эписомы представляют собой плазмиду или вирусную ДНК, похожую на счеты, которая обладает способностью включаться в хромосомную ДНК организма, в котором она находится. Вот почему он может оставаться на месте в течение длительного периода и воспроизводиться в каждом клеточном делении хозяина. Он также может в конечном итоге стать неотъемлемой частью его генетического состава.Классификация плазмид на основе их способности передаваться другим бактериямКонъюгативные плазмиды: Конъюгативные плазмиды содержат «тра» (половая передача генетического материала), которые выполняют сложный процесс конъюгации. Это перенос плазмид в другую бактерию.Неконъюгативные плазмиды: неконъюгативные Plas не могут инициировать конъюгацию, поэтому их можно передавать только с помощью конъюгативных плазмид.Промежуточные классы плазмид: промежуточные классы могут быть мобилизованы и несут только одно подмножество генов, необходимых для переноса. Они также могут паразитировать на удлиненной плазмиде и передавать с высокой скоростью только тогда, когда она присутствует. Плазмиды в настоящее время используются для манипулирования ДНК и могут быть методом лечения различных заболеваний.Репликация плазмид.Плазмиды реплицируются независимо, потому что они способны реплицироваться независимо благодаря своим собственным источникам. Ферменты, участвующие в репродукции плазмид, являются обычными клеточными ферментами, особенно в случае плазмид меньшего размера. Однако некоторые плазмиды имеют гены, кодирующие специфические ферменты для репликации плазмид.Плазмиды имеют небольшое количество генов, обычно менее 30, и эти гены участвуют преимущественно в контроле процесса инициации репликации, а также в распределении реплицированных плазмид в дочерние клетки. Генетическая информация, содержащаяся в плазмидных генах, не является жизненно важной для хозяина, поскольку бактерии без них обычно нормально функционируют.Поскольку сама плазмидная ДНК очень мала и очень мала, ее репликация происходит очень быстро, возможно, в одну десятую или меньше, чем продолжительность клеточного деления.Большинство плазмид, обнаруженных в грамотрицательных бактериях, реплицируются аналогично процессу репликации бактериального генома, при этом хромосома начинается в точке начала репликации при двунаправленной репликации кольцевой ДНК, что приводит к Тета (О) середине. .Но некоторые плазмиды грамотрицательных бактерий реплицируются однонаправленными методами. Большинство грамположительных плазмид реплицируются с использованием циклического процесса, аналогичного тому, который используют фаги phx174. Большинство линейных плазмид воспроизводятся с использованием механизма, который включает белок, связанный с 5'-концами каждой цепи ДНК, используемый для инициации синтеза ДНК.Функции плазмид.Плазмиды позволяют популяциям бактерий (включая различные миры) «пробовать» горизонтальный генофонд, чтобы идентифицировать адаптивные черты, которые могут быть выгодны для выживания под давлением местного отбора.Плазмиды также допускают генетическую изменчивость, действуют как источник рекомбинации и обеспечивают более быструю фиксацию генов, что повышает вероятность сохранения «новых» характеристик.Ключевая роль в процессе формирования Играют решающую роль в. Многие плазмиды обладают по крайней мере двумя различными маркерами, которые придают бактериям различные характеристики. Некоторыми из этих маркеров являются устойчивость к противомикробным препаратам (ampR) или экспрессия в ферменте, который катализирует реакцию, вызывающую изменение цвета (lacZ).Плазмиды и устойчивость к ампициллину.Некоторые плазмиды содержат гены ampR, которые придают устойчивость к ампициллину, антибиотику. Клетки бактерий E., содержащие эту плазмиду, называемые клетками «+ampR», способны развиваться и расти в колонии на агаре LB, в который добавлен ампициллин. Однако клетки, которые не имеют плазмид ampR, также известные как клетки «-ampR», устойчивы к антибиотику, который их устраняет. Чувствительные к ампициллину клетки (ampR) способны трансформироваться в устойчивые к ампициллину (+ampR) клетки за счет принятия внешней плазмиды, содержащей гены ampR.Плазмиды играют решающую роль и в генной инженерии. Плазмиды являются очень ценными инструментами в области генетики и молекулярной биологии, особенно в области генной инженерии. Они играют важную роль в таких процедурах, как создание генов, клонирование и производство рекомбинантных белков (например, инсулина у людей) и исследованиях в области генной терапии. В этих процессах плазмида разрезается в определенном месте (или местах) ферментами, известными как эндонуклеазы рестрикции.Плазмиды являются переносчиками. Плазмиды являются важными векторами горизонтального переноса генов и важными инструментами генной инженерии. Они кодируют гены, которые участвуют в различных аспектах микробной биохимии, включая детоксикацию и вирулентность, экологические взаимодействия, а также устойчивость к антибиотикам.Плазмиды создали множество механизмов лекарственной устойчивости. Роль, которую плазмиды играют в эволюции бактериального генома, а также в адаптации к изменениям в окружающей среде, была основным фактором в появлении антибиотиков, а также плазмид с высокой резистентностью.Плазмиды используются в генной терапии. Эффективность генной терапии зависит от успешного введения терапевтических генов в правильные хромосомные мишени в геноме человека, не вызывая повреждения клеток, а также онкогенных мутаций, запускающих иммунную реакцию. В то время как вирусные векторы являются отличным средством для высокоэффективной передачи клеток человека, проблемы безопасности, связанные с ними, делают более привлекательной невирусную доставку терапевтических генов с использованием плазмидной ДНК клеток.Плазмидный векторВектор — это компонент молекулы, содержащий генетический материал, который может быть продублирован и экспрессирован при переносе в другую клетку. В свете этого определения легко понять, почему термины «вектор» и «плазмиды» часто используются как синонимы. Но это не означает, что все плазмиды можно считать векторами.Одной из основных характеристик плазмидных векторов является их небольшой размер. В дополнение к их размеру они также имеют точку начала репликации, специфический маркер и несколько сайтов клонирования.Наиболее эффективными плазмидными векторами являются те, которые имеют большое количество копий внутри клетки. Поэтому они гарантируют, что существует множество копий гена, предназначенного для клонирования в определенных целях. Это также гарантирует, что важный ген усиливается в процессе геномного деления. Кроме того, плазмида может содержать ген-индикатор, который действует как визуальный маркер, помогающий определить, был ли процесс клонирования успешным.Из-за множества сайтов для клонирования плазмиды являются одними из лучших источников для клонирования. Из-за этого можно использовать рестрикционные ферменты, которые расщепляют несколько частей плазмиды, чтобы сделать возможным клонирование.В прошлом использование этих векторов сделало возможным введение рекомбинантной ДНК в клетки-хозяева для исследований в исследовательских целях. В частности, с помощью этого метода клонирования ученые смогли секвенировать геномы различных видов, изучить, как экспрессируются гены, и даже исследовать различные клеточные процессы.Хотя меньшие плазмиды могут нести длинные сегменты ДНК, их меньший размер также может позволить удалить несущественные гены, которые не нужны для клонирования.Выделение плазмид.Чтобы получить чистую плазмидную ДНК для таких процессов, как клонирование и трансфекция и ПЦР, необходимо провести процесс выделения плазмиды. Это включает в себя использование различных методов для сбора плазмидной ДНК клеток-хозяев, чтобы использовать ее для молекулярной биологии. Экстракция плазмиды включает несколько этапов.Развитие клеток (рост бактериальных клеток) – процесс включает рост бактерий, содержащих плазмиду, в определенной встряхиваемой культуре. Антибиотики могут быть использованы для подавления роста нежелательных бактерий.Центрифугирование - за ростом бактерий следует центрифугирование для удаления клеток. После удаления супернатанта можно выделить плазмиды.Наиболее известным методом выделения является классический метод, который часто называют щелочным лизисом. Он включает следующие шаги:Суспензия осадка в изотоническом растворе Осадок бактерий, полученный центрифугированием, можно ресуспендировать в изотонической жидкости (этилендиаминтетраацетат), которая блокирует активность нуклеазы.Клетки лизируются щелочью — это процесс удаления клеток с помощью додецилсеры натрия для разрушения липидной структуры клеточной мембраны.Осаждение белков, которые растворяют с помощью раствора кислого ацетата калияПроцесс осаждения, центрифугирование, используется, чтобы помочь в осаждении.Очистка Для очистки плазмиды ДНК используется смесь хлороформа и фенола. Эта процедура удаляет белок из ДНК.Включите этанол, чтобы помочь осаждению (для просеивания через центрифугирование).Очистите раствор, используя 70% этанола (чтобы избавиться от соли).Центрифуга для удаления плазмидной ДНКВ растворах ТЭ растворить и хранить в контейнере для хранения.12. Пример плазмид.12.1. Плазмида pBR322.PBR322 представляет собой плазмиду, которая была одним из первых широко используемых векторов для клонирования E. coli. Он был создан в 1977 году в лаборатории Герберта Бойера в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Он был назван в честь Франсиско Боливара Сапаты, исследователя с докторской степенью, и Раймонда Л. Родригеса. Буква p означает «плазмида», а BR означает «Боливар», а также «Родригес».Геном pBR322 имеет длину 4361 пару оснований. Он также содержит два гена устойчивости к антибиотикам — ген bla, кодирующий белок устойчивости к ампициллину (AmpR), а также ген tetA, кодирующий белок устойчивости к тетрациклину (TetR). Это источник репликации pMB1 и гена rop, который кодирует фактор рестрикции количества копий плазмиды. Плазмида уникальна своими сайтами рестрикции, которые используются более чем сорока ферментами рестрикции. Одиннадцать из сорока сайтов расположены внутри гена TetR. В промоторе гена TetR есть два фермента рестрикции HindIII и ClaI. В гене AmpR есть шесть важных сайтов рестрикции. Происхождение этих генов устойчивости происходит от pSC101 для тетрациклина, а также от RSF2124 для производства ампициллина.Его кольцевая структура названа таким образом, что 0 представляет собой отличительный сайт EcoRI посередине, а число увеличивается с геном TetR. Если вам нужно избавиться, например, от ампициллина, вы должны использовать рестрикционную эндонуклеазу или молекулярные ножницы для удаления. ПстИ. Затем pBR322 становится антирезистентным к ампициллину. Идентичную процедуру инсерционной инактивации можно использовать и для тетрациклина. Этот ген известен как ген AmpR, кодирующий бета-лактамазу пенициллина. Промоторы P1, а также P3 являются генами бета-лактамаз. P3 является первичным промотором, а P1 получают лигированием двух фрагментов ДНК, чтобы получить pBR322. P2 расположен в той же области, что и P1, однако он расположен на противоположной цепи и начинает транскрипцию, направленную на ген TCR.12.2. Ti Плазмида.Плазмида, индуцирующая опухоль, обнаружена в бактериальной Agrobacterium Tumefaciens.Он широко используется для клонирования векторов с целью переноса желаемых генов в растения-хозяева с целью создания трансгенных растений. Наиболее важные черты плазмиды Ti включают:Размер плазмиды около 250kbpСуществует множество плазмид Ti, основанных на различных генах, которые они несут и которые кодируют разные опиоиды, например. лейцинопин, нопалин, октопин и др.Возбудитель – вид, поражающий многочисленные двудольные растения. Он отвечает за развитие болезни, известной как коронный галл у растений.Он включает один или несколько участков Т-ДНК.Agrobacterium tumifaciens способна превращать нормальные клетки в опухолевые за счет введения фрагмента ДНК, известного как Т-ДНК. он начинает производить химические вещества, которые необходимы бактерии.Как только ген вставлен в плазмиду Ti, плазмида больше не является патогенной, но все еще может вводить желаемый ген в клетки растений.Он имеет vir или ген вирулентности, который переносит участок Т-ДНК в клетки растений и встраивается в геном растений.Плазмида Ti может быть изменена в соответствии с необходимостью вставки желаемых генов.Agrobacterium tubifaciens называют «генетическим инженером природы».3. РЕКОМБИНАТНЫЕ ПЛАЗМИДЫ.«Генно-инженерный микроорганизм» (ГЕМ), в настоящее время обычно известный как «генетически модифицированный микроорганизм» модифицированный микроорганизм» (ГМО), определяется Европейской комиссией (ЕС) как «микроорганизм, генетический материал которого изменен таким образом, что происходят естественным образом путем спаривания или естественной рекомбинации» (EC, 1990a). Организм может быть изменены путем перестройки или удаления нативного генетического материала или путем введения гетерологичная или «чужая» ДНК другого вида. Чужой ген может быть введенный в хромосому штамма-реципиента или «хозяина», где он может быть стабильно поддерживается; то есть ген реплицируется как неотъемлемая часть хромосомы хозяина, поэтому что одна копия гена наследуется обеими дочерними клетками в каждом клеточном цикле разделение. Однако по ряду причин чаще вводятся чужеродные гены. хозяину как компоненты мультикопийных плазмид. Плазмиды представляют собой автономно реплицирующиеся внехромосомные генетические элементы (т. молекулы ДНК, содержащие ориджин репликации), которые встречаются в природе в большинстве случаев, если не все, микробные виды. Встречающиеся в природе плазмиды могут иметь размер от 2kb до более чем 100kb. Количество копий молекулы плазмиды в каждой клетке (копия число) характерно для плазмиды, хотя оно может варьироваться от хозяина к хозяину и быть модифицируется изменениями в окружающей среде (см. раздел 5.1.2) и колеблется от единицы до несколько сотен. Как правило, большие плазмиды имеют небольшое количество копий, в то время как маленькие плазмиды имеют большое число копий (Sherratt, 1986). Штамм-хозяин может содержать больше чем один тип плазмиды, при условии, что плазмиды совместимы. Плазмиды, которые имеют очень похожие структуры, как правило, не могут быть размещены в одном и том же хозяине и тогда они относятся к одной и той же группе несовместимости (Novick, 1987).Мало что известно о функциях или эволюции плазмид в природе, за исключением того, что многие из плазмид, которые были выделены и охарактеризованы из различных виды содержат гены ферментов, которые инактивируют или иным образом нейтрализуют антибиотики. (Davies and Smith, 1978; Foster, 1983) или защищать хозяина от токсического действия тяжелые металлы (Сильвер и Мисра, 1988). Эти плазмиды дают преимущество хозяину. Штамм, позволяющий расти в неблагоприятных условиях. Однако какое бы преимущество они ни могут передать их естественным хозяевам, плазмиды оказались чрезвычайно полезными для ученые и биотехнологи как векторы внедрения чужеродной ДНК в бактерии и другие микроорганизмы.3.1. Конструирование рекомбинантных плазмид.В 1973 г. Коэн и соавт. опубликовали свою теперь известную статью, в которой описали связывание ДНК-фрагменты в репликон бактериальной плазмиды и последующее введение составной, химерной, молекула в Escherichia coli путем трансформации. Хотя за прошедшие 19 лет произошло большое количество разработок в области манипуляций с ДНК, технологии, методы, которые Cohen et al. описанные в этой статье по-прежнему по существу стандартные методы переноса генов (Maniatis et al., 1982; Rodriguez and Тайт, 1983). ДНК из штамма, содержащего плазмиду, экстрагируют и плазмидную ДНК отделяют от хромосомной ДНК и очищают. Подобно бактериальной хромосоме, плазмиды бактериального происхождения обычно представляют собой ковалентно замкнутые кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, но их можно линеаризовать путем разрезания с рестрикцией типа II эндонуклеазой (Roberts, 1982), если плазмида содержит один уникальную сайт-мишень для этого фермента (сайт клонирования). Эндонуклеазы рестрикции обычно разрезают двухцепочечные ДНК асимметрично, в результате чего образуются линейные плазмидные молекулы с «липкими концами», короткие комплементарные одноцепочечные последовательности на каждом конце молекулы. Вставляемая ДНК также обрабатывается эндонуклеазой, которая генерирует фрагменты с одинаковыми липкими концами, так что при смешивании плазмиды и ДНК-вставки при подходящих условиях отжиг происходит между комплементарными последовательностями. Фермент-лигаза (Weiss et al., 1968) используется для образования ковалентной связи между вставкой и векторная ДНК.3.2. Геномная ДНК и клонирование кДНК.Если чужеродная ДНК имеет бактериальное происхождение, приготовление вставочного фрагмента относительно простое. Тотальную бактериальную ДНК очищают, расщепляют эндонуклеазой рестрикции, и фрагмент, содержащий интересующий ген, идентифицируют, выделяют и лигируют в ДНК плазмидный вектор. Однако расположение генов в эукариотических хромосомах более сложное. Внутри генов кодирующие последовательности часто чередуются с некодирующие последовательности (Breathnach and Chambon, 1981). Хромосомная ДНК из высшие организмы редко передаются непосредственно бактериальному хозяину. Вместо этого РНК транскрипт гена используется в качестве матрицы для обратной транскриптазы (Verma, 1977) для того, чтобы синтезировать молекулу ДНК (кДНК), содержащую только кодирующие последовательности.3.3. Генетический обмен.Многие виды бактерий обладают природной способностью поглощать ДНК и включать ее в геном. Следовательно, за миллиарды лет бактерии эволюционировали посредством процесса, сходного с генной инженерии. Эта естественная способность к поглощению ДНК используется в различных способах для создания рекомбинантных плазмид в линиях клеток-хозяев (клонах).Трансформация, поглощение ДНК через клеточную мембрану, является наиболее частым методом и используется для введения рекомбинантных плазмид в бактерии. Некоторые бактерии имеют естественную способность к восприятию ДНК (Tomasz, 1969; Hotchkiss and Gabor, 1970). Например, трансформация Bacillus subtilis рекомбинантными плазмидами относительно проста (Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971; Van Randen and Venema, 1984). Некоторые грамотрицательные бактерии, такие как E. coli, Pseudomomas putida и Azotobacter vinelandii могут поглощать плазмидную ДНК, если клетки обработать двухвалентным катионы (Cohen et al., 1972; Chakrabarty et al., 1975; David et al., 1981). В некоторых бактериях и дрожжах, клеточная стенка должна быть удалена, прежде чем станет возможной трансформация (Hinnen, et al., 1978; deVos and Venema, 1981; Hopwood and Chater, 1982; Кацумата и др., 1984). Электропорация, при которой поглощение ДНК облегчается электрохимическим градиентом повышает эффективность трансформации у некоторых видов (Hashimoto et al., 1985; Somkuti and Steinburg, 1987; Wolf et al., 1989; Conchas and Карниэль, 1990).Конъюгация является альтернативным методом введения плазмидной ДНК хозяину, что позволяет создавать векторы на основе конъюгативных плазмид широкого круга хозяев, таких как RP4 (Datta and Hedges, 1972), для введения почти во все виды грамотрицательных бактерии (Томас и Смит, 1987). Также возможна конъюгация с некоторыми видами Streptomyces (Lydiate et al., 1985) и плазмидами Streptococcus (Oultram и Янг, 1985). Векторы, полученные из ДНК бактериофага, могут быть введены хозяину через инфекцию.Случайное появление генов устойчивости к антибиотикам на большинстве плазмид может быть использовано для выделения трансформантов. Клоны, несущие плазмиду, могут быть положительно отбраны путем посева на среду, содержащую антибиотик. Устойчивый к антибиотикам фенотип также используется для поддержания штаммов, содержащих плазмиды, в организме. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:https://www.slideshare.net/Dilippandya/plasmidhttps://www.slideshare.net/doctorrao/plasmids-6828679https://www.cd-genomics.com/blog/plasmid-fact-sheet-definition-structure-and-application/https://www.news-medical.net/life-sciences/What-are-Plasmids.aspxhttps://www.microscopemaster.com/plasmids.htmlhttps://www.slideshare.net/15paratr/plasmids-13031139