Методы молекулярно-генетических исследований

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярно-генетические методы исследований стали достижением биологической науки второй половины XX ст. Они позволяют изучить саму структуру ДНК, определить сходства и отличия ДНК разных организмов, их участков, найти повреждения в структуре ДНК и даже расшифровать первичную последовательность оснований в ДНК или РНК.Молекулярно-генетические исследования — это разнообразные методы и методики. Общим для всех их является, во-первых, выделение образца ДНК исследуемого организма и, во-вторых, использование генно-инженерных технологий. Для получения ДНК берут любые клетки, которые содержат ядра. Чаще всего у человека — это лейкоциты крови, клетки слизистой оболочки рта (для их получения достаточно легко провести шпателем по внутренней поверхности щеки) или, если изучается геном эмбриона, — околоплодная жидкость.
Преимущество молекулярно-генетических методов в том, что для их проведения необходимо совсем незначительное количество материала. Изучить ДНК организма можно по одному единственному волосу, ничтожному мазку крови, малюсенькому кусочку кожи или кости.
Для проведения молекулярно-генетических исследований почти всегда используют только небольшой фрагмент ДНК, содержащий интересующие гены. Для получения такого фрагмента применяют специальные ферменты рестриктазы (от лат. рестрикций — ограничение). Их особенностью является то, что они режут молекулу ДНК в строго определённом месте. Используя наборы разных рестриктаз, удаётся вырезать из молекулы ДНК нужные фрагменты небольшого размера.
Следующий этап — увеличение количества полученных фрагментов ДНК. Это возможно благодаря способности молекулы ДНК к самоудвоению. Увеличение копий ДНК называют амплификацией (от лат. амплификацио — усиление, увеличение).
В живом организме амплификация — естественный процесс репликации ДНК, а в лабораторных условиях его подменяет специальная методика — полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полученная ДНК является материалом для исследований.Современные молекулярно-генетические методы позволяют с наивысшей точностью установить родственные отношения двух особей, в том числе и давно умерших людей, если доступны их биологические материалы (кости, волосы).
Суть методики проста: сравнивая определённые участки ДНК разных людей, определяют степень сходства последовательности нуклеотидов этих участков. Именно так были идентифицированы члены погибшей семьи последнего российского императора Николая II. 

1. Молекулярно-генетические методы

В рамках проведения генетической диагностики плода используются следующие методы исследований:FISH (флуоресцентная гибридизация). Стандартный и сравнительно недорогой метод генетической диагностики, отличающийся малым сроком проведения (несколько часов). Широко применяется в клиниках репруктологии России и стран постсоветского пространства. В медицинской практике развитых стран сейчас используется редко из-за относительно невысокой точности исследования из-за того, что анализу подвергаются не все хромосомы.CGH (сравнительная геномная гибридизация). 
Этот метод отличается большой стоимостью и продолжительностью исследования. Среди преимуществ – широкий перечень выявляемых аномалий и высокая точность результатов. Также с помощью этой технологии врач может определить шанс успешной имплантации конкретного эмбриона.ПЦР (полимеразно-цепная реакция). С его помощью определяют резус-фактор и группу крови эмбриона, а также некоторые генетические аномалии.
Особенность данной технологии в том, что она требует предварительного обследования обоих биологических родителей на хромосомные нарушения. Из-за этого он не применим в том случае, если ЭКО проводится с использованием донорских ооцитов или эмбрионов.NGS (секвенирование нового поколения). Собирательное название нескольких методик определения нуклеотидной последовательности ДНК эмбриональных клеток, позволяющих составить ее полное формальное описание. Достаточно дорогая технология, которая, тем не менее, сегодня считается одной из наиболее эффективных, поэтому широко используется в диагностической практике.

1.1. FISH (флуоресцентная гибридизация).
Метод гибридизации in situ* (на месте, лат.) основан на способности ДНК или РНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК / РНК - зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.Для проведения гибридизации in situ пригодны цитологические или гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приготовленные по стандартным методикам.
В условиях клинической цитогенетической лаборатории используют препараты культивированных лимфоцитов периферической крови, клеток цитотрофобласта хорионального эпителия, культивированных и некультивированных клеток амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, а также мазков клеток буккального эпителия и крови.Метод гибридизации in situ имеет особое значение для практической цитогенетики, благодаря разработке неизотопного варианта, основанного на использовании зондов, меченных нерадиоактивными модифицированными нуклеотидами. Неизотопные варианты гибридизации на препаратах (в особенности флюоресцентные) имеют ряд преимуществ по сравнению с изотопными: большую разрешающую способность, которая равна разрешающей способности микроскопа (0,1 - 0,2 мкм), отсутствие необходимости в статистической обработке результатов, быстроту и безопасность для здоровья исследователейКроме того, комбинация различно модифицированных проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одной клетке или на одной метафазной пластинке.
А использование в качестве ДНК-зондов повторяющихся последовательностей, меченых флюорохромами, сокращает время проведения процедуры до 7 - 9 часов (классический неизотопный вариант гибридизации занимает два дня, изотопные варианты от недели до месяца), что особенно важно для пренатальной диагностики. Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ численных нарушений хромосомного набора, как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах.

Принцип FISH-метода
В основе FISH-метода лежит реакция гибридизации между искусственно созданным ДНК-зондом и комплементраной ему нуклеотидной последовательностью ядерной ДНК.
Молекула ДНК представляет собой две спирально соединенные нуклеотидные цепи, а гибридизация возможна только в том случае, если цепи разойдутся. Чтобы разъединить нуклеотидные цепи ДНК прибегают к денатурации (для последующей гибридизации денатурированной должна быть как ДНК в ядрах исследуемого образца, так и сам ДНК-зонд). После денатурации ДНК-зонд гибридизуется с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа.Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1. Подготовка гистологического или цитологического препарата.Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.
2.Предварительная обработка (если необходимо).Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.
3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация.Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85-90°С.
4.Гибридизация.После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37°С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.
5.Промывка.После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).
6.Контр-окрашивание.При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.
7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа. Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

1.2. CGH (сравнительная геномная гибридизация).Технология, обладающая высоким разрешением, с помощью которой появилась возможность проведения объективной оценки количественного и качественного нарушения в структуре хромосомного набора, получила название «Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах (aCGH)». Данная методика позволяет провести полноценный анализ всех 24 хромосом из набора гаметы. Для проведения анализа специалисту нашего центра достаточно 1 клетки.
Высокая достоверность метода подтверждена много численными исследованиями экспериментальным путем. Погрешность составляет всего 1,9% и только 2,9% всех отобранных эмбрионов оказались непригодны для проведения диагностики.Чтобы  HYPERLINK "https://www.ivf-nn.ru/uslugi/inseminatsiya-spermoy/" инсеминация дала положительные результаты, требуется отобрать наиболее здоровый и жизнеспособный эмбрион. Выполнение анализа происходит по классической экспериментальной схеме: используется два образца генетического материала – контрольный, заведомо здоровый, с полностью проверенным набором хромосом, и исследуемый. Применяется в отношении мужских и женских клеток.На образцы клеток наносятся специальные зонды, после чего материал переносится на микрочип, который несет последовательности олигонуклеотидов. На 1 хромосому приходится 60000 точек покрытия. Далее проводится проверка  с использованием цветных маркеров. Интенсивность получаемого сигнала соответствует численности участка.
Красный цвет сигналит о том, что на участке численность увеличена. Зеленый напротив сигнализирует о том, что участок «потерян».Компьютер проводит сканирование и в результате наш специалист получает диаграмму о состоянии генома. График представлен в виде прямой, на которой отмечены пары хромосом. Напротив каждой пары отображаются дефектные хромосомы – прямая разрывается с помещением метки зеленого или красного цвета, сигналящих о нехватке или удвоении участка.Выбор метода ЭКО определяется превалирующим фактором бесплодия. Если спермограмма мужчины имеет нормальные показатели, то оплодотворение яйцеклетки проводит путем «in vitro». Искусственная инсеминация в данном случае производится не в цервикальном канале женщины, а в пробирке.При наличии проблем в мужском генетическом материале выбираются методы инъекции сперматозоида (ИКСИ, ИМСИ, пИКСИ), когда врач отбирает необходимую половую клетку и микроиглой вводит ее в женский ооцит.Для проведения анализа CGH метод «in vitro» не подходит. Дело в том, что при его применении участвуют несколько сперматозоидов и часть из них, хоть и не оплодотворяют яйцеклетку, но делают попытки проникнуть сквозь ее оболочку, тем самым оставляя свой генетический след на ее поверхности.
В последствие эти «следы» могут дать ложные показатели, которые снизят валидность (достоверность) результатов исследования.При проведении анализа эмбрионы подвергаются криоконсервации. Дело в том, что процедура проводится на 5-6 день после оплодотворения, когда уже началось первичное деление клеток оплодотворенного яйца и образовалась бластоциста. Бластоцисты маркируют и дублируют маркер на соответствующих образцах биопсийных проб. Отобранные образцы материалов отправляются на сканирование, а бластоцисты консервируют. По результатам анализа клетки с выявленными аномалиями утилизируют, а эмбрионы прошедшие проверку размораживаются для переноса в женскую матку.Для анализа используется специальный микрочип, который рассчитан на 12-14 эмбрионов. Стоимость чипа довольно высокая, что заставляет женщин ждать набора образцов для полного заполнения. Если пара хочет ускорить процедуру, то «свободные места» придется оплатить дополнительно. В среднем нашему центру требуется 7-10 дней, чтобы набрать требуемое количество эмбрионов для анализа.
По результатам анализа специалист-генетик НМК делает заключение, с которым женщину знакомят на очередной консультации. Выбор эмбриона для переноса осуществляется совместно, после чего нужный образец размораживают и производится подсадка в полость матки.В процедуре геномной гибридизации выделяют 3 объективных достоинства:Так как весь процесс сканирования возлагается на компьютерную программу, фактор человеческой ошибки минимален. Генетик занимается исключительно интерпретацией результатов.
При использовании анализа продуктивность ЭКО составляет до 70%. Более того, отбор единственного идеального эмбриона позволяет исключить фактор многоплодной беременности.Возможность деления процедуры на этапы с проведением анализа ограниченного числа эмбрионов, в то время как остальной материал консервируется. Если выбранная партия полностью отбраковывается, то требуется обследование следующей группы.Специалисты нашего центра дают возможность парам в период поведения исследований комфортно распределять финансовые расходы.

1.3. Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация».
Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).
Основные принципы
Итак, ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой.
Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами.
Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:
1) денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
2) отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
3) элонгация ДНК (полимераза синтезирует цепь ДНК) - 72°С - 1 минута (время зависит от длины синтезируемого фрагмента).
Приборная база для применения метода полимеразной цепной реакции в лаборатории должна состоять из:
 - амплификатора(или, как его еще называют, термоциклера);
- системы для гель-электрофореза с источником питания (для визуализации результатов ПЦР);
- системы гель-документации(для анализа результатов ПЦР);
- ПЦР-бокса(для пробоподготовки);
- вортекса;
- микроцентрифуги;
- набора автоматических дозаторов (механических или электронных).
Помимо основного и вспомогательного оборудования для полноценного функционирования ПЦР-лаборатории, необходимы некоторые расходные материалы: стерильные наконечники, пробирки, штативы для пробирок и дозаторов.
Реагентная база в обычной ПЦР-лаборатории для проведения полноценной полимеразной цепной реакции включает в себя фермент ДНК-полимеразу с буфером, праймеры (небольшие синтетические фрагменты ДНК, комплементарные началу и концу анализируемого участка ДНК-матрицы), смесь нуклеотидов (А, Т, Г, Ц). Также абсолютно необходима очищенная вода.
Достоинства метода ПЦР
Высокая чувствительность исследования
Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток.
Специфичность анализа
ПЦР позволяет выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование. Специфически подбирая компоненты реакции (праймеры), Вы можете одновременно выявлять ДНК близкородственных микроорганизмов.
Универсальность метода ПЦР
Дело в том, что для ПЦР-диагностики инфекционных заболеваний, либо наследственных заболеваний человека можно использовать одно и то же оборудование, следовать универсальным процедурам подготовки образцов (проб) и постановки анализа, а также однотипные наборы реактивов.
Экономия времени
Важное преимущество ПЦР – отсутствие стадий культуральной микробиологической работы. Подготовка образцов, проведение реакции и анализ результатов максимально облегчен и во многом автоматизирован. Благодаря этому, время получения результата может сокращаться до 4-5 часов.
Эффективность метода ПЦР
ПЦР помогает избежать известных сложностей, возникающих при выращивании труднокультивируемых, некультивируемых или персистирующих форм микроорганизмов для диагностики латентных и хронических инфекций. Эффективен метод ПЦР и при скрининге возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, а также внутриклеточных паразитов.
Широта исследуемого клинического материала
В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое.
Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы – позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях.

1.4. NGS (секвенирование нового поколения)NGS, или next generation sequencing, — секвенирование нового поколения. Термин означает определение нуклеотидной последовательности (исследование первичной структуры) ДНК или РНК. Секвенировать можно и другие биополимерные молекулы, например белки, но в этой статье речь пойдет только о нуклеиновых кислотах.
В настоящее время применяется несколько вариантов метода. Один из наиболее распространенных — секвенирование по Сэнгеру. Преимуществом является высокая точность и относительно низкая стоимость при исследовании небольших фрагментов ДНК. Недостатком является низкая пропускная способность и дороговизна при исследовании большого объема данных. Именно эти минусы стали основой для разработки и внедрения более современной технологии — NGS.
Особенности NGSНеобходимость разработки NGS была обусловлена стремлением к автоматизации анализа, увеличению объема получаемой информации и снижению стоимости исследования. Принцип технологии NGS основан на массовом одновременном секвенировании тысяч фрагментов ДНК на базе подготовленных однонитевых библиотек. Методика включает три этапа:подготовка библиотек;сиквенс;анализ полученных данных.
Преимущества NGS:
- снижение стоимости исследования;
- автоматизация анализа;
- большой объем получаемой информации.
Методы NGS имеют большую производительность, позволяют выполнять одновременное считывание миллиардов коротких фрагментов нуклеиновых кислот. Кроме того, NGS дает возможность проводить секвенирование сразу нескольких десятков геномов за один запуск анализатора.Виды NGSТехнология секвенирования следующего поколения может быть реализована на основе следующих методов:
Пиросеквенирование — основано на регистрации пирофосфата, образующегося при мобилизации очередного нуклеотида на матрицу ДНК. Регистрация пирофосфата производится посредством каскада химических реакций, в конце которого выделяется квант света.
Секвенирование на молекулярных кластерах также происходит на базе синтеза новой молекулы ДНК на основании матрицы. Она крепится на поверхности проточной ячейки, а детекция осуществляется посредством флуоресцентной метки нуклеотидов.
Техническое лигазное секвенирование в отличие от предыдущих методов использует образование химических связей между нуклеотидами посредством лигазы. Клональная библиотека наносится на магнитные сферы и помещается в проточную ячейку. Последовательность нуклеотидов определяется с помощью отщепляющейся флуоресцентной метки.
Ионное полупроводниковое секвенирование основано на использовании полупроводниковых микрочипов. В момент удлинения синтезируемой цепи на один нуклеотид происходит изменение рН на микрочипе. Оно регистрируется, и таким образом определяется последовательность нуклеотидов.
Одномолекулярное секвенирование относится к методам третьего поколения. Оно позволило отказаться от полимеразной цепной реакции на этапе пробоподготовки и дает возможность следить за наращиванием синтезируемой цепи в режиме реального времени.

Области применения NGS
Секвенирование генома de novo — расшифровка ранее неизученного генома. Используется в бактериологии, вирусологии и др.Полногеномное ресеквенирование.Направленное ресеквенирование генов, про которые известно, что наличие в них мутации приводит к развитию заболевания.Секвенирование РНК — проводится для оценки экспрессии генов.
При этом можно оценивать как кодирующие, так и регуляторные РНК.Метагеномное секвенирование — позволяет определить состав организмов в исследуемом образце, например, в материале, взятом из кишечника или ротовой полости.

2. Молекулярные методы

2.1. Молекулярное клонирование
Молекулярное клонирование (генная инженерия, технология рекомбинантных ДНК) – это совокупность методов, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой.Молекулярное клонирование состоит из следующих этапов:
1) Выделение ДНК из организма – донора;
2) Расщепление ДНК ферментами рестриктазами с образованием фрагментов ДНК с «липкими концами»;
3) Расщепление векторной молекулы (плазмида, фаг, космида и др.) той же рестриктазой, что и исследуемый образец ДНК;
4) Лигирование (сшивание) векторной молекулы и фрагмента исследуемой ДНК с образованием гибридной (рекомбинантной) молекулы;
5) Введение рекомбинантной молекулы в клетку-хозяина (реципиента).
Этот процесс называется трансформацией.
Отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки);Получение специфического белкового продукта, синтезируемого клетками-хозяевами.
Для молекулярного клонирования необходимо:
- Ферменты рестриктазы
- Клонирующий вектор
- Встраиваемая ДНК (ген, фрагмент гена)
- Рестриктазы – ферменты, разрезающие ДНК в строго определенном месте (сайте).
Рестриктазы выделяют из клеток бактерий разных видов. Каждая рестриктаза узнает только свой сайт рестрикции. В настоящее время выделено более 500 рестриктаз.
Например, рестриктаза EcoRI узнает и расщепляет ДНК по палиндромной нуклеотидной последовательности GAATTC. В результате расщепления образуются комплементарные одноцепочечные «липкие» концы:GAATTCCTTAAG → обработка рестриктазой EcoRI →G AATTCCTTAAG GВекторами для молекулярного клонирования являются молекулы ДНК, которые могут доставлять в клетку-хозяина чужеродную ДНК. Вектор должен быть небольшого размера, иметь сайт рестрикции, в который может быть осуществлена вставка, иметь один или более селективный генетический маркер для отбора реципиентных клеток, несущих чужеродную ДНК. Векторами для клонирования являются:
Плазмиды – кольцевые двухцепочечные экстрахромосомные самореплицирующиеся молекулы ДНК бактерий. В плазмидах клонируют фрагменты ДНК до 10 т.п.н.Фаги. Первыми были разработаны выкторы на основе фага λ E. coli. ДНК фага λ составляет примерно 50 т.п.н. Значительная часть (20т.п.н.) несущественна для размножения фага и может быть заменена на чужеродную ДНК. В фаге можно клонировать фрагмент ДНК до 20т.п.н.Космиды – векторы, объединяющие в себе свойства плазмиды и фага. Созданы искусственно. Могут амплифицироваться в бактерии как плазмиды и упаковываться в фаговые головки. Могут включать вставку чужеродной ДНК до 40т.п.н.
Искусственная дрожжевая хромосома (yeast artificial chromosome –YAC). Вектор разработан на основе ДНК дрожжей. Применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (от 100 до 1000 т.п.н.) эукариот.С использованием технологий рекомбинантных ДНК получают инсулин, соматотропный и другие гормоны человека.

2.2. Метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов
Значительное число нуклеотидных замен приводит к появлению в последовательности ДНК новых сайтов для различных рестриктаз. В результате нормальный фрагмент ДНК и фрагмент с заменой нуклеотида будут разрезаться одной рестриктазой на разное число фрагментов, отличающихся по длине. Различной длины фрагменты легко выявляются при помощи электрофореза.Примером может служить рестрикционный анализ фрагмента гена алькогольдегидрогеназы (ADH). После ПЦР образуется фрагмент 165 н.п. Аллель ADH-1 не несет замены, после его обработки рестриктазой MaeIII при электрофорезе выявляются 2 фрагмента (98 и 68 н.п.). Аллель ADH-2 несет нуклеотидную замену (при замене образуется лишний сайт для рестриктазы) и после рестрикции разрезается на 3 фрагмента (63, 36 и 68 н.п.).ЗАКЛЮЧЕНИЕМолекулярно-генетические методы, благодаря их большой точности, используют в судебной медицине, например, метод «генетических отпечатков пальцев».
 Из минимального количества биологического материала, найденного на месте преступления (крови, слюны, волос, спермы), выделяют ДНК и расщепляют её на фрагменты. Эти фрагменты разделяют в специальных носителях, получая картинку расположения полос, которую и называют генетическими отпечатками пальцев. Она уникальна для каждого человека, совпадая только у однояйцевых близнецов. Ведь каждый человек по нюансам нуклеотидных последовательностей, как и по папиллярным узорам, уникален. «Генетические отпечатки пальцев» вносят в специальную базу и точно так же, как настоящие отпечатки пальцев сравнивают с «генетическими отпечатками пальцев» подозреваемого. Этот метод также позволяет установить отцовство - у родителей и детей отпечатки в определённой степени похожи.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Баранов, В. С. Молекулярная медицина: молекулярная диагностика, превентивная медицина и генная терапия // Молекулярная биология. — 2000. — Т. 34. — Вып. 4. — С. 684—695.Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак ; под ред. Н. К. Янковского. — Москва : Мир, 2002.Жимулёв, И. Ф. Общая и молекулярная генетика / И. Ф. Жиму- лёв. — Новосибирск : Изд-во Сибирского ун-та, 2003. — 479 с.Примроус, С. Геномика. Роль в медицине / С. Примроус, Р. Твай- мен. — Москва : Бином. Лаборатория знаний, 2008. — 277 с.Ребриков, Д. В. ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков, Г. А. Са- матов, Д. Ю. Трофимов. — 7-е изд. — Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2018. — 224 с.Скворцова, Н. Н. Основы молекулярной биологии : учебное пособие / Н. Н. Скворцова. — Санкт-Петербург : Университет ИТМО; ИХиБТ, 2015. — 74 с.Франк-Каменецкий, М. Д. Самая главная молекула. От структуры ДНК к биомедицине XXI века / М. Д. Франк-Каменецкий. — 2-е изд. - Москва : Альпина нон-фикшн, 2018. — 336 с.