Открытие ключевых регуляторов клеточного цикла 2001

Введение. Актуальностью является открытие лауреатов Нобелевской премии 2001 года в области медицины имеет большое значение для понимания на молекулярном уровне законов нарушения клеточных механизмов и регуляции перехода клетки от стадии к стадии, что позволит в будущем решать проблему лечения рака и создания эффективных лекарственных препаратов.
Нобелевская премия в области медицины и физиологии в размере миллиона долларов была вручена 8 октября прошлого года. Чести были удостоены трое ученых: американец Лиланд Хартвелл (Leland H. Hartwell) и британцы Тимоти Хант (R. Timothy Hunt) и Пол Нерс (Paul M. Nurse). Тема их исследований звучала так: «Ключевые регуляторы клеточного цикла».
По мнению Нобелевского комитета по медицине и физиологии, исследования этих ученых позволяют «выявить дефекты в контроле клеточного цикла, проявляющиеся, в частности, в хромосомных изменениях, видимых в неопластических клетках. Знание этих недостатков потенциально может открыть дверь к лечению рака.
Цель работы: изучение открытии ключевых регуляторов клеточного цикла 2001
Задачи работы:
- описать открытия ключевых регуляторов клеточного цикла
- узнать причины, которые влияют на переход к различным фазам клеточного цикла

Глава 1. Нобелевские премии 2001 года клеточного цикла1.1 Клеточный цикл: универсальный механизм для дрожжей и человекаНобелевскую премию по физиологии и медицине 2001 года разделили американец Леланд Х. Хартвелл и два британца Р. Тимоти Хант и Пол М. Нерс. Вы будете удостоены этой престижной награды за открытие генетических и молекулярных механизмов, регулирующих клеточный цикл, процесс, необходимый для роста, развития и существования живых организмов.
Все живые существа состоят из клеток. Клетки, в которых хромосомы расположены в ядре и отделены от остальной части клетки мембраной, называются эукариотическими. Они появились на Земле около двух миллиардов лет назад. Организмы, состоящие из таких клеток, могут быть как одноклеточными (например, дрожжи и амебы), так и многоклеточными (растения и животные).
У взрослого человека примерно сто тысяч миллиардов клеток, и все они развились из яйца в результате длинной цепочки последовательных делений. Этот процесс продолжается: старые клетки умирают, а их место занимают молодые. Чтобы клетка могла делиться, она должна расти, делать копии своих хромосом и передавать их обеим дочерним клеткам. Эти стадии составляют единый клеточный цикл. Очень важно, чтобы разные фазы цикла были согласованы. Ошибки координации приводят к аномалиям: хромосомы или их части могут быть потеряны, спутаны или неравномерно разделены между дочерними клетками. Эти хромосомные дефекты часто встречаются в раковых клетках.
Уже более века известно, что клетки воспроизводятся путем деления, но молекулярные механизмы, лежащие в основе клеточного цикла, оставались неясными до начала 1970-х годов, когда появилось новаторское исследование Ли Хартвелла. Он выяснил, какие гены регулируют клеточный цикл пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и получил мутантные штаммы дрожжей, которые перестали делиться при изменении температуры. Хартвелл идентифицировал более сотни генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, включая ген CDC28, известный как «стартовый» ген. Именно этот ген запускает процесс копирования ДНК на стадии предварительного деления. Хартвелл показал, что, хотя разные стадии клеточного цикла контролируются разными генами, между ними существует замечательная взаимосвязь: следующая стадия не начинается, пока не завершится предыдущая. Изучив чувствительность дрожжевых клеток к радиации, Хартвелл ввел концепцию «контрольной точки» в конце 1980-х, то есть контрольной точки, в которой клеточный цикл прерывается, чтобы проверить, все ли в порядке. Если обнаруживается дефект какой-либо части ДНК, запускается механизм их устранения, и только после этого цикл возобновляется. Вероятно, что многие виды рака связаны со сбоями на этих контрольно-пропускных пунктах.
Пол Нерс, как и Хартвелл, экспериментировал с дрожжами, но использовал другой сорт - Schizosaccharomyces pombe. Они очень дальние родственники пекарских дрожжей, их эволюционное разделение произошло более миллиарда лет назад. Используя генетический подход, разработанный Хартвеллом, Нерс обнаружила, что ген, который действует как запускающий ген, кодирует фермент из семейства циклин-зависимых киназ (CDK). Этот фермент как бы направляет клетку через клеточный цикл, стимулируя химическую модификацию других белков. В 1987 году Медсестра выделила соответствующий ген в клетках человека.
Вклад Тима Ханта заключался в открытии циклинов, нового класса белков, которые играют ключевую роль в контроле клеточного деления. Циклины названы так потому, что их концентрация периодически изменяется в соответствии со стадиями клеточного цикла, в частности, она уменьшается до начала деления клеток. Хант обнаружил первый циклин в начале 1980-х, экспериментируя с яйцами лягушек и морских ежей. Позже циклины были обнаружены и у других живых организмов, и оказалось, что эти белки не сильно изменились в ходе эволюции. Циклины регулируют активность CDK. Если мы образно сравним CDK с двигателем, циклин - это «муфта», которая определяет, будет ли «двигатель» переключать цикл ячейки с одной фазы на другую или же он будет работать на холостом ходу.
Удивительно, но механизм контроля клеточного цикла практически не изменился в ходе эволюции и дошел от простых дрожжевых клеток до людей в «консервативной» форме.
Биомедицинские перспективы сделанных открытий - это, во-первых, разработка новых методов диагностики и лечения рака. Установлено, что в некоторых опухолях содержание CDK выше нормы, а значит, вещества, подавляющие его активность, могут стать основой для нового поколения противоопухолевых препаратов.
1.2 Причины, которые влияют на переход к различным фазам клеточного циклаЦиклины
Циклины - это группа родственных белков, один из важнейших регуляторов цикла ядерной клетки. Как у человека, так и у большинства других эукариот существует четыре основных типа: циклины G1, циклины G1 / S, циклины S и циклины M.
Как следует из названия, каждый циклин связан с определенной фазой, переходом или набором фаз в клеточном цикле и помогает контролировать события этой фазы или периода. Например, М-циклин способствует событиям М-фазы, таким как разрушение ядерной оболочки и хромосомная конденсация.

Рис. 1. Цикл экспрессии циклиновЧтобы продвинуть клеточный цикл вперед, циклин должен активировать или инактивировать многие целевые белки в клетке. Циклины контролируют события клеточного цикла, взаимодействуя с семейством ферментов, называемых циклин-зависимыми киназами (Cdks). Сам по себе Cdk неактивен, но после связывания с циклином он активируется, становясь функциональным ферментом и приобретая способность модифицировать целевые белки.
Как это работает? Cdks - это киназы, ферменты, которые фосфорилируют (присоединяют фосфатные группы) к определенным целевым белкам. Присоединенная фосфатная группа действует как переключатель, делая целевой белок более или менее активным. Когда циклин связывается с Cdk, он имеет два важных эффекта: он активирует Cdk как киназу и направляет Cdk к определенному набору целевых белков, которые различаются для разных фаз клеточного цикла, контролируемого каждым конкретным циклином. Например, циклины G1 / S отправляют Cdk к мишеням S-фазы (например, путем стимуляции репликации ДНК), в то время как M-циклины отправляют Cdk к мишеням M-фазы (например, путем разрушения ядерной мембраны).

Рис. 2. Циклин-зависимые киназы ( Cdks)
В общем, уровни Cdk остаются относительно постоянными на протяжении клеточного цикла, но активность Cdk и целевые белки изменяются по мере того, как уровни различных циклинов повышаются и понижаются. В дополнение к тому факту, что Cdks должен связываться с циклином, он также должен фосфорилироваться в определенном сайте для активации (не показан на диаграммах в этой статье), и он также может отрицательно регулироваться фосфорилированием в других сайтах.
Циклины и Cdk в высшей степени эволюционно консервативны, что означает, что они обнаружены у многих видов, от дрожжей до лягушек и людей. Детали системы немного различаются: например, у дрожжей есть только один Cdk, в то время как у людей и других млекопитающих есть несколько CD, которые используются на разных стадиях клеточного цикла. Да, это своего рода исключение из правила, что «уровни концентрации CDK не меняются». Но основные принципы очень похожи, так что Cdk и разные типы циклинов можно найти у каждого вида.
Фактор, способствующий созреванию (MPF)
Известный пример того, как циклины и Cdks работают вместе, чтобы контролировать переходы клеточного цикла, - фактор, способствующий созреванию (MPF). Название восходит к 1970-м годам, когда исследователи обнаружили, что клетки в фазе M содержат неизвестный фактор, который может заставить яйца лягушки (которые остановились в фазе G2) перейти в фазу M. Эта загадочная молекула, названная MPF, была открыта в 1980 году. . -s как Cdk, связанный со своим партнером М-циклином.
MPF - хороший пример того, как циклины и Cdks могут работать вместе, чтобы управлять переходом клеточного цикла. Как и типичный циклин, M-циклин остается низким на протяжении большей части клеточного цикла, но его концентрация увеличивается по мере приближения клетки к G2 / M-соединению. По мере накопления М-циклин он связывается с Cdks, уже присутствующими в клетке, образуя комплексы, готовые к началу М-фазы. Как только эти комплексы получают дополнительный сигнал (фактически, совершенно четкое подтверждение того, что ДНК клетки не повреждена), они становятся активными и приводят в движение события М-фазы.
Комплексы MPF добавляют фосфатные метки к нескольким различным белкам в ядерной оболочке, что приводит к его деградации (ключевому событию ранней M-фазы), а также активирует мишени, которые способствуют конденсации хромосом и другим событиям M-фазы. Роль MPF в разрушении ядерной оболочки в упрощенном виде показана на диаграмме ниже.

Рис. 3. Cdk и M cyclin объединяются в MPF
Упрощенная схема, показывающая, как Cdk и M cyclin объединяются в MPF.
Левая панель: комплекс MPF фосфорилирует различные мишени, специфичные для М-фазы, в то время как фосфорилированные мишени вызывают образование веретена, конденсацию хромосом, разрушение ядерной мембраны и другие события ранней М-фазы.
Правая панель: конкретный пример MPF, вызывающего разрушение ядерной оболочки. Комплекс MPF фосфорилирует белки ядерной оболочки, что приводит к фрагментации ядерной мембраны на везикулы (и высвобождению некоторых белков из мембраны).
Помимо подпитки событий M-фазы, MPF также запускает собственное разрушение, активируя комплекс, стимулирующий анафазу / циклосомы (APC / C), белковый комплекс, который вызывает разрушение M-циклинов во время наступления анафазы. Разрушение М-циклинов выводит клетки из митоза и позволяет новым дочерним клеткам войти в фазу G1. APC / C также вызывает разрушение белков, которые удерживают сестринские хроматиды вместе, позволяя им разделяться в анафазе и мигрировать к противоположным полюсам клетки.
Как APC / C выполняет свою работу? Подобно Cdk, APC / C является ферментом, но имеет другой тип функции, чем Cdk. Вместо того, чтобы прикреплять фосфатную группу к своим мишеням, он добавляет небольшую белковую метку, называемую убиквитином (Ub). Когда цель помечена убиквитином, она отправляется в протеасому (которую можно рассматривать как мусорную корзину клетки) и уничтожается. Например, APC / C прикрепляет убиквитиновую метку к М-циклинам, заставляя их расщепляться протеасомой и позволяя вновь образованным дочерним клеткам войти в фазу G1.
APC / C также использует маркеры убиквитина для запуска разделения сестринских хроматид во время митоза. Если APC / C получает правильные сигналы в метафазе, он запускает цепочку событий, которая разрушает когезин, белковый клей, который скрепляет сестринские хроматиды.
APC / C сначала добавляет метку убиквитина к белку секурин и отправляет его на обработку. Секурин обычно связывает и инактивирует белок, называемый сепаразой (сепарин).
Когда секурин отправляется на переработку, сепараза становится активной и может выполнять свою работу. Сепараза, в свою очередь, измельчает когезин, белок, который удерживает сестринские хроматиды вместе, тем самым разделяя сестринские хроматиды.

Рис.4. Анафаза-стимулирующий комплекс/циклосома (APC/C)
Контрольные точки и регуляторы
Cdks, циклины и APC / C являются прямыми регуляторами клеточного цикла, но они не всегда контролируют процесс. Вместо этого они реагируют на сигналы внутри и вне клетки. Эти сигналы влияют на активность ядерных регуляторов, чтобы определить, может ли клетка продвигаться в клеточном цикле. Положительные сигналы, такие как факторы роста, обычно увеличивают активность Cdks и циклинов, тогда как отрицательные сигналы, такие как повреждение ДНК, обычно снижают или блокируют их активность.
Например, давайте посмотрим, как повреждение ДНК останавливает клеточный цикл в G1. Повреждение ДНК может происходить и происходит во многих клетках тела в течение жизни человека (например, из-за ультрафиолетовых лучей солнца). Клетки должны иметь возможность справляться с этим повреждением, ремонтируя его, если это возможно, и останавливая его деление, если повреждение не может быть восстановлено. Ключом к ответу на повреждение ДНК является белок p53, хорошо известный супрессор опухолей, который часто называют «хранителем генома».
p53 работает на разных уровнях, чтобы гарантировать, что клетки не передают свою поврежденную ДНК дочерним клеткам после деления.
Во-первых, он останавливает клеточный цикл в контрольной точке G1 и запускает производство белков-ингибиторов Cdk (CKI). Белки CKI связываются с комплексами циклинов Cdk и блокируют их активность (см. Рисунок ниже), экономя время на репарацию ДНК.
Вторая задача p53 - активировать ферменты репарации ДНК.
Когда повреждение ДНК не может быть восстановлено, р53 играет свою третью и последнюю роль - он запускает запрограммированную гибель клеток, так что поврежденная ДНК не передается.
Глава 2. Открытие ключевых регуляторов клеточного цикла2.1 Клеточный цикл как центральная система контроля• CDK являются основными регуляторами клеточного цикла и активны только тогда, когда они находятся в комплексе с другими белками циклинов.
• Циклины получили свое название, потому что их уровень в клетке периодически меняется в течение клеточного цикла.
• На разных стадиях клеточного цикла CDK может образовывать комплекс с несколькими циклинами.
Клеточный цикл контролируется центральной системой управления. Ключевым компонентом этой системы является небольшое семейство протеинкиназ, называемых циклин-зависимыми киназами или CDK. Эта киназа представляет собой комплекс двух полипептидов. Один из них, CDK, связывает АТФ и содержит активный сайт.
Однако он обладает киназной активностью только в сочетании с другим полипептидом, называемым циклином. На рисунке ниже показано, что связывание с циклином вызывает конформационные изменения в молекуле CDK, в результате чего субстрат получает доступ к каталитическому сайту. Активность каждого комплекса CDK с циклином изменяется таким образом, что происходит только в определенных фазах клеточного цикла, а в остальное время комплекс остается в неактивном состоянии.
Различные протеинкиназы активны на разных фазах клеточного цикла. Некоторые из них активны в течение периода G1, другие - во время репликации клеточной ДНК, а третьи - во время митоза. В течение относительно короткого периода активности каждая из киназ фосфорилирует большое количество белков, либо активируя их и запуская основные события клеточного цикла, либо ингибируя их активность, при этом повторение предыдущего цикла предотвращает событие. Например, CDK, которая инициирует митоз, фосфорилирует разрушенные белки, и ядерная оболочка разрушается. Он также фосфорилирует множество других белков, которые регулируют сборку митотического веретена.

Рис. 5. CDK вызывает в последней конформационные изменения.
Т-образная петля меняет свое положение, что обеспечивает доступ к подложкам.
Также происходит переориентация боковых цепей некоторых аминокислот,
в результате индуцируются изменения, необходимые для переноса фосфатных групп.
Впервые CDK были идентифицированы при исследовании мутантов дрожжей cdc. Секвенирование ДНК гена cdc2 + S. pombe оказалось гомологичным гену CDC28 почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Фактически, было показано, что ген почкующихся клеток может функционально заменять ген делящихся дрожжей. Другими словами, когда этот ген был трансфицирован в дрожжевые мутантные клетки cdc2ts, они могли расти при недопустимых температурах. Это указывало на то, что исследователи имели дело с ортологичными белками, то есть с белками, выполняющими ту же функцию. Затем было показано, что эти белки являются протеинкиназами.
Когда гомолог этого гена (CDC2), присутствующий в клетках человека, был выделен путем генетической комплементации с использованием мутанта cdc2 S. pombe (CDC2), стало очевидно, что киназа является эволюционным регулятором митоза. Это предположение стимулировало дальнейший поиск общих белков, участвующих в контроле цикла в разных клетках, и общих принципов регуляции деления эукариотических клеток. В оставшейся части этой главы мы используем его родовое название Cdk1 для обозначения гена киназы вместо названия, которое учитывает тот или иной организм (cdc2, CDC28, CDC2).
Изучение деления эмбриональных клеток морского ежа и моллюска в начале 1980-х гг. Тим Хант и другие сотрудники лаборатории Джоан Рудерман отметили периодические изменения в уровне белка, которые уменьшались по мере начала расщепления. Позднее эти белки были названы циклинами. Такие периодические колебания в изменении уровня белка были обнаружены только в исследованиях на отдельных клетках или на популяции клеток, которые вступили в цикл синхронно.
Изменения уровня белков были очень выраженными; накопление белков происходило в интерфазе из-за их синтеза, а затем их содержание резко падало в результате протеолиза, как раз перед началом разделения хромосом в начале анафазы. Появление и исчезновение двух белков происходило синхронно с клеточным циклом и в каждом делении. Такая периодичность появления циклина свидетельствует о том, что он образует комплекс с CDK, и поэтому киназа активна только в течение определенных коротких периодов каждого клеточного цикла.
Дальнейший прогресс в выяснении роли CDKs и cyclins был достигнут после элегантных и оригинальных исследований контроля клеточного цикла у Xenopus laevis. Был выявлен фактор, способствующий созреванию (субъект продвижения / созревания, MPF). Обладает мейотической активностью созревания ооцитов лягушки. Последующая очистка фактора и его биохимическая характеристика показали, что он состоит из Cdk1 и циклина. Теперь известно, что активность MPF заметно увеличивается и уменьшается с каждым митозом или мейозом. Это схематично показано на рисунке ниже. Резкое падение уровня белка связано с протеолизом циклина, а повышение частично связано с увеличением его содержания. Идентификации MPF способствовало открытие, что подобные белки контролируют клеточный цикл у всех эукариот.
2.2 Организация клеточного циклаУ некоторых организмов одного циклина и одной CDK достаточно для организации клеточного цикла. Например, в дрожжевых клетках S. pombe имеется только одна CDK и только один тип циклина, и один и тот же комплекс CDK-циклин вызывает переходы G1 / S и G2 / M. Эти данные несовместимы с представлением о том, что комплексы CDK-циклин вызвать только одно преобразование. Следовательно, предполагается, что для того, чтобы клетка прошла через эти две трансформации, необходимы разные уровни активности циклина CDK.

Рис. 6. Изменения уровня цикла
Ученые открыли первые циклины, когда заметили, что их повышенный уровень связан с началом митоза в эмбриональных клетках. После окончания митоза уровень циклина резко падает.
При более низком уровне активности начинается S-фаза, а при более высоком уровне активности происходит митоз. Поскольку уровень циклина в клетке со временем увеличивается, вы можете использовать этот механизм для запуска перехода клетки в S-фазу и в митоз. Это происходит в правильном порядке и при участии того же комплекса CDK-циклин.
У большинства организмов многие циклины работают в течение каждого клеточного цикла, и эти разные белки появляются и исчезают на разных стадиях. В то же время, в зависимости от названия фазы клеточного цикла, в которой они присутствуют, циклины подразделяются на три класса: G1-циклины, ответственные за переход цикла от фазы G1 к фазе S; Циклины в S-фазе, которые необходимы для инициации репликации ДНК; и М-фаза или митотические циклины, инициирующие митоз. Многие клетки содержат более одного члена каждого класса циклинов; даже простые эукариоты, такие как дрожжи S. cerevisiae, содержат девять различных циклинов. Все девять взаимодействуют с одной и той же каталитической субъединицей.
Поскольку каталитическая субъединица в каждом комплексе CDK одинакова, субъединицы циклина должны не только активировать субъединицу киназы, но также распознавать белки, требующие фосфорилирования.
У метазоа различные классы циклинов обычно обозначаются буквами. Циклин D связан с G1, а циклины A и E связаны с фазой S. Циклины A и B связаны с митозом.
Наряду со многими классами циклинов, для большинства многоклеточных эукариот характерно наличие нескольких представителей каждого класса (обозначенных циклинами B1, B2 и т. Д.). Таким образом, общее количество циклинов довольно велико. Например, геном человека кодирует по меньшей мере 12 циклинов, которые участвуют в регуляции клеточного цикла. Зачем клетке столько циклинов? Сегодня накоплено большое количество данных о большом количестве организмов, которые показывают, что большое количество вариантов циклина обеспечивает различные способы их регуляции.
Таким образом, некоторые циклины обнаруживаются только в определенных частях клетки, таких как ядро ​​или центросома, в то время как другие присутствуют не во всех, а только в определенных тканях животных. Уровень циклинов также можно регулировать с течением времени, т.е. различные циклины, характерные для любой фазы цикла, могут появляться или исчезать в зависимости от времени. Важность такой регуляции еще не совсем ясна, но возможно, что клеточный цикл должен быть совместим с типом клетки. Таким образом, крупным животным, для которых характерно наличие многих типов клеток, требуется большое количество циклинов.
Хотя разные члены семейства циклинов встречаются в разное время цикла и в разных частях клетки, они обладают общими молекулярными свойствами. В своей первичной структуре они имеют последовательность примерно из 150 аминокислот, называемую циклиновым доменом. Эта последовательность представляет собой область, через которую циклин связывается с каталитической субъединицей CDK. Вне домена циклина первичная последовательность циклинов значительно различается по составу, хотя многие циклины содержат там гидрофобную область, которая участвует в распознавании субстрата. Несмотря на различия, между циклинами существует значительная функциональная избыточность, и один циклин может заменять другой, хотя и не всегда с одинаковым результатом. Эта избыточность была впервые обнаружена у дрожжей, а теперь она проявляется в клетках мыши. Например, в отсутствие циклина E мыши развиваются и живут нормально. Следовательно, возможно, что другие циклины компенсируют потерю этого циклина, участвующего в инициации S-фазы, хотя они обычно не выполняют его внутренних функций.
Клетки метазоа также содержат несколько циклин-зависимых киназ. Киназа CDK1 играет важную роль в митозе, а CDK2, CDK4 и CDK6 участвуют на ранних стадиях клеточного цикла. Большинство киназ связываются с одним или двумя разными циклинами, и каждая CDK имеет свой собственный набор циклинов. Следовательно, в то или иное время клетка содержит множество различных комплексов CDK-циклин. Различные комбинации субъединиц CDK и циклина позволяют очень тонко регулировать в определенные моменты жизни клетки и в определенном месте. Это касается как одиночной клетки, так и многоклеточного организма. Также следует иметь в виду, что для каждого комплекса CDK-циклин существует определенный набор субстратов. Стадии клеточного цикла млекопитающих, в которых действуют различные циклины CDK, показаны на рисунке ниже справа.
ЗаключениеПодводя итог вышесказанному, подчеркнем, что переход клеток на разные стадии цикла регулируется комплексами CDK-циклин. Циклины - это белки, уровни которых в клетке колеблются в зависимости от фаз цикла. Таким образом, специфичность отдельных фаз клеточного цикла определяется активностью CDK, регулируемой циклинами.
В работе изученили открытии ключевых регуляторов клеточного цикла 2001
Выполнили задачи:
- описали открытия ключевых регуляторов клеточного цикла
- узнали причины, которые влияют на переход к различным фазам клеточного цикла

Список литературыhttps://www.nkj.ru/archive/articles/3800/https://openlongevity.org/school_101_cell_cycle_regulatorshttps://meduniver.com/Medical/genetika/cdk_kak_regulator_kletochnogo_cikla.html
ПриложениеИзменения уровня MPF в митотическом цикле позволяют предполагать, что он служит регулятором митоза.

В клетках делящихся дрожжей различные переходы в клеточном цикле контролируются единственным CDK-циклиновым комплексом (Cdk1-циклин В) (левый рисунок), в то время как в клетках млекопитающих эти же задачи выполняют различные CDK-циклиновые комплексы (правый рисунок).


График, иллюстрирующий положение, согласно которому различные пороговые значения активности одной Cdk1 стимулируют различные процессы в цикле делящихся дрожжевых клеток.