Тема "Методы редактирования генома". Очень понятный текст и поменьше...

ВВЕДЕНИЕ. Приступая к рассмотрению основных методов редактирования генома, стоит остановиться на трактовке понятия «редактирование генома». Данное понятие обобщает целый ряд методик, которые подразумевают точное и целенаправленное изменение конкретных строительных элементов ДНК.
В связи с большим разнообразием данных методик и для выявления их отличительных особенностей, востребованности и эффективности применения, нами и была выбрана тема данной работы, которая звучит как «Методы редактирования генома».
Цель данной работы – изучить основные методы редактирования генома.
В связи с данной целью нами были поставлены следующие задачи:
1. проанализировать основные этапы становления методов геномного редактирования;
2. изучить действие физических факторов и химических агентов на индуцированный мутагенез;
3. выявить особенности индуцированной полиплоидии;
4. рассмотреть основные методы геномного редактирования;
5. познакомиться с методом праймированного редактирования.
Основные этапы становления методов геномного редактирования1.1. Действие физических факторов и химических агентов на индуцированный мутагенез. Индуцированная полиплоидия
В 1927 г. американским генетиком Г.К. Мёллером было показано влияние радиации на наследственность: изменения в генетическом аппарате дрозофилы возникают под воздействием рентгеновских лучей [10].
Благодаря открытию Г.К. Мёллера начались многочисленные исследования в этом направлении:
- L.J.Stadler (США) - радиационный мутагенез кукурузы, овса, гексаплоидной пшеницы [15];
- А.А. Сапегин (СССР) - радиационный мутагенез мягкой пшеницы [14].
В настоящее время также проводятся работы по радиационному мутагенезу, благодаря чему созданы различные ценные сорта сельскохозяйственных растений (рентгеновское излучение, γ-лучи, быстрые нейтроны и другие источники ионизирующего излучения) [12, 8, 16, 11].
Известный советский ученый Н.К. Кольцов занимался поиском химических веществ, которые влияют на наследственность. В 1930 годах аналогичные исследования проводились его учениками В.В. Сахаровым и М.Е. Лобашевым, однако, применяемые ими реагенты (йод и уксусная кислота) оказались слабыми и не способными вызвать большое число мутаций.
Другим учеником Н.К. Кольцова И.А. Рапопортом перед войной были обнаружены вещества, которые вызывают заметное число мутаций [3].
Стоит отметить, что И.А. Рапопорт испытал большое количество соединений разной природы и среди них обнаружил сильные мутагены [4].
Далее остановимся на особенностях индуцированной полиплоидии.
В настоящее время примерно для 70% растений характерен природный полиплоидный статус, при этом достаточно и диплоидных видов.
Стоит отметить, что для полиплоидов характерно:
- увеличение размеров клеток и органов (листьев, цветков, плодов),
- повышение содержания некоторых целевых метаболитов и др.
В связи с этим в селекции стремятся к направленному искусственному получению полиплоидных форм.
При этом у растений удвоение числа хромосом обычно производят под действием алкалоида трополонового ряда колхицина, который выделяется из безвременника осеннего.
Стоит отметить, что подобных искусственных полиплоидных растений, над которыми произвели геномную мутацию в виде дупликации всего генома, в нашей стране и за рубежом получено уже достаточно много [2].
1.2. Основные методы геномного редактирования
Геномное редактирование осуществляется с помощью:
- химерных олигонуклеотидов,
- мегануклеаз,
- ZF нуклеаз,
- TALE нуклеаз,
- CRISPR/Cas технологии,
- искусственных молекулярных «ножниц» ARCUT.
Впервые мутагенез с использованием химерных олигонуклеотидов был проведен в 1999 г. [6].
Стоит отметить, что существуют различные вариации мутагенеза при помощи олигонуклеотидных конструкций.
Однако, перспективы использования данного подхода небольшие, так как:
- низкая эффективность процесса внесения мутаций,
- серьезные трудности отбора желательных растений.
Также одним из методов геномного редактирования является применение двуцепочечных разрывов в ДНК, а также мегануклеаз.
Для наибольшей эффективности рекомбинации требуется внесение в целевой участок ДНК двуцепочечных разрывов, для чего подходят так называемые мегануклеазы. Благодаря возникающему двуцепочечному разрыву в данное место генома за счет рекомбинации довольно легко можно вставлять новый участок ДНК [13].
Далее остановимся на особенностях редактирования геномов с помощью ZF нуклеаз.
Итак, двуцепочечные разрывы в молекуле ДНК значительно повышают эффективность рекомбинации, в связи с этим такие разрывы необходимо создавать. Для высокой эффективности предложено использовать химерную нуклеазу. При этом в качестве узнающего домена используют «цинковые пальцы». Так, объединив их с каталитическим доменом рестриктазы FokI, превратили фактически в ZF нуклеазу.
Стоит отметить, что наиболее сложным в ZF редактировании геномов является конструирование цинковых пальцев, которые являются специфичными к нуклеотидной последовательности.
Еще одним методом редактирования геномов является TALEN технология. Она отличается простотой и лучшей эффективностью внесения целевых мутаций в геномы разных организмов. В основе данной технологии лежит использование TALE нуклеазы. Стоит отметить, что для наибольшей эффективности редактирования генома с помощью TALEN технологии был написан ряд компьютерных программ, которые рассчитаны на поиск мест редактирования, дизайн генно-инженерных конструкций, а также выявление нецелевых сайтов [9].
Далее отметим, что в настоящее время главенствующей является CRISPR/Cas технология редактирования геномов из-за ее заметного превосходства над остальными. Так, главными ее преимуществами служат относительная простота и быстрота подготовительных процедур. При этом точность вносимых в геном изменений достаточно высока за счет разных усовершенствований данной технологии [1].
Далее остановимся на использовании искусственных молекулярных «ножниц» ARCUT при редактировании геномов.
Так, некоторые авторы сравнивают ARCUT с ZFN геномным редактированием, а также использованием мегануклеаз. Однако, установлено, что новых организмов с таким образом отредактированными геномами пока не получено [7].
2. Новые методы редактирования генома2.1. Метод праймированного редактированияСогласно данным, опубликованным в журнале Nature, ученые из Гарварда предложили новый способ редактирования ДНК.
Так, ими была использована вирусная обратная транскриптаза, чтобы вписать в ДНК требуемый вариант последовательности [5].
Данный метод получил название «метод праймированного редактирования». Благодаря его использованию можно исправить любой тип мутаций: от точечных замен до вставок или делеций.
При этом, по мнению исследователей, опробовавших его на различных типах клеток человека, данный метод работает точнее, чем CRISPR/Cas9. Использование данного метода не требует внесения двуцепочечных разрывов.
Как считают авторы данного метода, успешное редактирование происходит примерно в 20-50 % случаев, а частота ошибочных вставок или делеций – не более 10 %.
Это означает, что данная система работает эффективнее, чем CRISPR/Cas9 - в подобных экспериментах ее эффективность примерно 10 % случаев. Кроме того, праймированное редактирование оказалось безопаснее (вызвало 0,58 % инделов, а CRISPR/Cas9 - 31 %).
Также большим преимуществом нового метода является его универсальность.
Так, при переписывании последовательности гена, у ученых появилась возможность устранения любой мутации (делеции, дупликации или точечной замены).
Было установлено, что данная система способна справиться с любыми заменами нуклеотидов, а также другими нарушениями последовательности гена.
При этом авторы работы убеждены, что их разработка может быть эффективно использована против 89 % патогенных генетических вариаций, представляющих собой небольшие изменения в последовательности ДНК (до 30 нуклеотидов).
ЗАКЛЮЧЕНИЕИзучив основные методы редактирования генома, можно сделать следующие выводы.
Индуцированный мутагенез и индуцированная полиплоидизация известны весьма давно, однако при этом до сих пор востребованы.
Из основных методов геномного редактирования в настоящее время «ножницы» ARCUT практически не используют, химерные олигонуклеотиды, мегануклеазы, ZF и TALEN технологии используют редко, поскольку их «превзошла» CRISPR/Cas технология, главными преимуществами которой служат относительная простота и быстрота подготовительных процедур. При этом точность вносимых в геном изменений достаточно высока за счет разных усовершенствований данной технологии.
Однако учеными из Гарварда был предложен новый способ редактирования ДНК - «метод праймированного редактирования». По мнению исследователей, опробовавших его на различных типах клеток человека, данный метод работает точнее, чем CRISPR/Cas9.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВВершинина, З. Р. / V. Z. R., Кулуев, Б. Р. / K. B. R., Геращенков, Г. А. / G. G. A., Князев, А. В. / K. A. V., Чемерис, Д. А. / C. D. A., Гумерова, Г. Р. / G. G. R., Баймиев, А. Х. / B. A. K., & Чемерис, А. В. / C. A. V. (2017). Эволюция Методов Редактирования Геномов / Evolution of Methods for Genome Editing. Биомика, 9(3), С. 245–270.
Навашин М.С., Герасимова Е.Н. Введение колхицина через корни с целью получения полиплоидных растений // ДАН СССР. - 1940. - Т.26. - С. 689-692.
Рапопорт И.А. Карбонильные соединения и химический механизм мутаций // Докл. АН СССР. - 1946. - Т.54. - С. 65-68.
Рапопорт И.А., Зоз Н.Н., Макарова С.И., Сальникова Т.В. (ред.) Супермутагены / М.: Наука. - 1966. - 272 с.
Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA / Nature 576, 149-157 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4
Beetham P.R., Kipp P.B., Sawycky X.L., Arntzen C.J., May G.D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999. V. 96. P. 8774- 8778.
Katada H., Komiyama M. Artificial restriction DNA cutters to promote homologous recombination in human cells // Current Gene Therapy. 2011. V. 11. P. 38-45.
Kodym A., Afza R. Physical and chemical mutagenesis // Methods Mol. Biol. 2003. V.236. P.189-204.
Miller J.C., Tan S., Qiao G., Barlow K.A., Wang J., Xia D.F., Meng X., Paschon D.E., Leung E., Hinkley S.J., Dulay G P., Hua K.L., Ankoudinova I., Cost G.J., Urnov F.D., Zhang H.S., Holmes M.C., Zhang L., Gregory P.D., Rebar E.J. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing // Nature Biotechnology. 2011. V. 29. P. 143-148.
Muller H.J. Artificial transmutation of the gene // Science. 1928. V.66. P.84-87.
Muthusamy A., Jayabalan N. Variations in seed protein content of cotton (Gossypium hirsutum L.) mutant lines by in vivo and in vitro mutagenesis // J. Environ. Biol. 2013. V.34. P.11-16.
Nilan R.A. Increasing the effectiveness, efficiency, and specificity of mutation induction in flowering plants // Genes, Enzymes, and Populations. 1973. P. 205-222.
Salomon S., Puchta H. Capture of genomic and T‐DNA sequences during double‐strand break repair in somatic plant cells // The EMBO Journal. 1998. V. 17. P. 6086-6095.
Sapehin, A. A. Röntgen-Mutationen beim Weizen (Triticum vulgare) // Der Züchter. 1930. V.2. P.257-259.
Stadler L.J. Some genetic effects of X-rays in plants // Journal of Heredity. 1930. V.21. P.3–20.
Waje C.K., Jun S.Y., Lee Y.K., Moon K.D., Choi Y.H., Kwon J.H. Seed viability and functional properties of broccoli sprouts during germination and 269 postharvest storage as affected by irradiation of seeds // J. Food Sci. 2009. V.74. P.C370-374.